鸭源H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆、序列分析及原核表达

参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×103.Western印迹表明表达蛋白具有免疫活性.     

表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白重组新城疫病毒耐热株的构建

应用反向遗传操作技术,将H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白基因替换重组新城疫病毒耐热rTS-GFP/M株的绿色荧光蛋白基因,构建表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组新城疫病毒rTS-HA/M株.蛋白表达检测和病毒特性分析结果表明,该重组病毒能够在BHK-21细胞中高效表达HA蛋白,具有与亲本毒株类似的增殖能力、耐热特性和低致病性.     

粘虫核型多角体病毒p35基因抑制细胞凋亡的功能研究

利用去血清方法建立Ls细胞凋亡的实验体系，证明LsNPV p35基因在Ls细胞中瞬时表达可以抑制Ls细胞由于无血清造成的凋亡，构建了在哺乳动物中高效表达LsNPV p35基因的载体pRc/RSV-L p35,并导入Vero细胞瞬时表达，发现LsNPV p35基因产物也可以抑制Vero细胞由于病毒感造成的凋亡，用含LsNPVp35的质粒与vAcAnb(AcNPV p35基因缺失病毒）DNA共转浸Sf-9细胞，可以使vAcAnhDNA在St-9细胞中形成多角体，并且传代后多角体不扩增，表明LsNPV p35基因与AcNPVp35基因具有功能互补性。     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.     

伪狂犬病毒TK基因转移载体构建及LacZ基因表达

在扩增、克隆PRVtk、gH基因的基础上,构建了包含tk和gH基因片段的转移载体质粒pTK2．5．以PRV糖蛋白gG启动子(PgG)为控制外源基因表达的启动子,以E．colilacZ为报道基因,用其替换pTK2．5质粒tk区的Sall与Xhol之间的序列,构建了转移载体质粒pTK．LacZ．瞬时表达证实,转染细胞的pTK—lacZ质粒在野生型PRV感染的情况下,能有效表达β-Gal酶活性．将pTK．1acZ转染BHK21细胞后再以PRV感染进行同源重组,在143TK-细胞上经5．溴脱氧尿苷选择,Vero细胞纯化,X-GaI染色,蓝斑筛选,分离到重组体PRV(rPRV)．rPRV与野生型PRV在细胞上具有类似的生长特性,且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-Gal酶活性．     

一株H5N1亚型禽流感毒的分离鉴定与基因组序列分析

对一株于2005年从浙江省分离获得的禽流感病毒株（A／Chicken／zhejiang／24／2005）进行了鉴定、全基因组序列测定、分析和致病性研究．经血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验证实，此分离病毒株为H5NI亚型．对该毒株的全基因组序列测定和分析显示，HA蛋白在HA1和HA2连接处，含有连续多碱性氨基酸模体（-RRKKR-）．进化分析结果表明，A／Chicken／zhejiang／24／2005（H5N1）7个基因来源于2004～2005年湖南地区流行株，但PB1基因来源于未知野禽毒株．动物实验结果显示，Ck／ZJ／24／05对鸡和鸭均具有高致病性，对小鼠无致病性，与HA的序列特征相符合．     

人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向成软骨样细胞的定向诱导分化

从人骨髓中分离和培养间充质干细胞(MSCs),在原代和传代培养中其形态学上均为贴壁、纤维状的细胞,随着代次的增加细胞形态更加趋于一致.流式细胞仪鉴定CD45、CD34、CD117、HLA-DR阴性,CD29、CD166阳性,并随着培养代次的增加,阳性比率和阴性比率出现相应的上升和降低,说明细胞中MSCs纯度增加.第三代细胞大约有80%处于G0/G1期,S+G2+M期约20%,说明MSCs有强大的增殖潜能.在传代培养中的最适接种密度为5 000个/cm2左右.MSCs在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期3个时期,传代培养的MSCs生长速度比原代的MSCs明显快很多.采用程序降温法对MSCs进行冻存,60～90 d后对冻存的MSCs进行复苏,发现MSCs仍可在体外良好生长4～6代,特定的MSCs样本可以扩增10代,说明经过冻存的细胞仍具有良好的增殖能力.对4例标本的前三代MSCs在体外利用TGF-β1和维生素C诱导两周后,用RT-PCR证明MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原的mRNA,说明培养的细胞具有向成软骨样细胞分化的潜能,由此进一步证实其为MSCs.     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

氯离子介导的白藜芦醇对心肌细胞缺氧复氧损伤保护作用

以H9c2心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤为模型,从细胞水平探讨白藜芦醇抗心肌急性损伤作用与细胞内Cl-变化的关系,以进一步阐明白藜芦醇的心肌保护作用机制.实验结果显示白藜芦醇能有效减轻A/R对心肌细胞的损害,表现为乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)活性降低,超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)的抗氧化活性升高和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量减少,细胞存活率明显升高;MQAE荧光分光光度计法测定心肌细胞内Cl-浓度,发现白藜芦醇亦能显著延缓A/R引起的心肌细胞内Cl-浓度的升高.白藜芦醇对Cl-浓度动态平衡的调节在其心肌保护作用中发挥重要作用.     

杆状病毒p35基因延缓昆虫细胞凋亡

构建了以新霉素抗性基因为筛选标记的带有ｐ３５基因的转移载体ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ，以此载体转染Ｓｆ９细胞，经Ｇ４１８筛选得到染色体上稳定整合质粒ｐ３５ＩＥ１Ｎｅｏ的Ｓｆ９细胞，克隆化培养后取名为Ｓｆ９－３５．经细胞原位杂交实验证明，Ｓｆ９－３５细胞的染色体ＤＮＡ上含有ｐ３５基因；经放线菌素Ｄ处理后的细胞核酸电泳检测，证实Ｓｆ９－３５具有抗凋亡特性能够支持凋亡抑制基因缺失的ｖＡｃΔｐ３５病毒复制；发现ｐ３５基因在细胞内组成型表达只能延缓ｖＡｃΔｐ３５感染及放线菌素Ｄ处理诱发的细胞凋亡的过程，而不能完全阻止其诱发的细胞凋亡．     

麻疹病毒(Nepal毒株)H基因的序列测定及其表达

提取麻疹病毒Ｎｅｐａｌ毒株的ＲＮＡ并利用逆转录ＰＣＲ方法特异性地扩增血凝素基因（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）．将Ｈ基因克隆并测定序列，结果表明新毒株的Ｈ基因与标准疫苗毒株Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ之间存在较多重要的基因变异，两者的同源性为９８．１７％．将Ｈ基因克隆到表达载体ｐＣＤ－ＳＲα中并利用电转染法转染ＣＯＳ－７细胞，利用血凝实验检测了Ｈ蛋白的表达及功能     

凋亡抑制基因P35对杆状病毒增殖的影响

以野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacali for nica Nuclear Polyhedrosis Virus,Ac     

三角褐指藻DGAT1基因生物信息学分析及表达调控研究

本研究采用转录组测序获得了三角褐指藻DGAT1基因cDNA全长序列(GeneBank登录号: 7200924), 并对其进行生物信息学分析和表达调控研究. 结果表明, 三角褐指藻DGAT1基因cDNA序列全长为1438bp, 开放阅读框(ORF)为1098bp, 编码365氨基酸序列, 含有脂肪酸蛋白特性(I)和DAG结合位点(II)等功能结构域. 预测三角褐指藻DGAT1蛋白为亲水性蛋白, 含有6个跨膜结构域和7个超强跨膜螺旋区, 无信号肽. 进化树分析表明, 三角褐指藻与海链藻DGAT1蛋白同源性最高. RT-qPCR结果表明, 光照强度和温度均显著促进三角褐指藻DGAT1基因的表达. 随着光照强度和温度的增加, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量呈先升高后降低趋势, 在光照强度为2500lx或温度为25℃时, 三角褐指藻DGAT1基因的表达量达到最大, 这与三角褐指藻总脂含量的变化趋势一致, 同样揭示DGAT1蛋白与三角褐指藻总脂生物合成与积累密切相关.     

贻贝壳在不同方法下合成羟基磷灰石多孔微球的性能研究

选用舟山市贻贝壳为原料制备羟基磷灰石(HA)多孔微球, 球形HA较其他形状的HA有更多的药物和金属负载量, 可以合成特殊的功能性材料. 实验过程为: 采用贻贝壳提取CaCO₃, 以贻贝壳的CaCO₃为原料用水热法、沉淀法、十六烷基三甲基溴化铵模板剂法及反相微乳液法制备HA, 经比较确定可行方案, 并对制备出的样品进行银离子吸附实验. 研究结果表明: 通过扫描电子显微镜表征观察得出水热法制备的产物为球形; X射线粉末衍射仪和傅里叶红外光谱仪测得水热法制得的产物为HA, 其他产物为方解石型CaCO₃/HA复合材料; 比表面积及微孔孔隙分析表征得出水热法制备的产物介孔结构和比表面积最优; 电感耦合等离子体发射光谱仪检测产物的钙磷比及载银量, 确定水热法制备的样品为缺磷型HA, 该HA的银离子吸附率达75.10%. 表明贝壳制备HA多孔微球是可行的, 采用水热法可将贝壳CaCO₃合成球形多孔HA, 且在转化程度和载银效果方面较其他方法更有优势.     

介导GAD基因的人泡沫病毒载体的构建及其应用

构建了两种新的重组人泡沫病毒载体pGPSNI—hGAD67和pGPSNI—hGAD65，分别携带人符氨酸脱羧酶（GAD）的两种同工酶GAD65和GAD67基因，并研究其在帕金森病（PD）模刭鼠丘脑底核中的表达及对帕金森病的治疗作用．RT—PCR结果表明，人泡沫病毒载体成功地介导了GAD65基因和GAD67基因在PD模型鼠丘脑底核中有效表达．动物行为检测表明，GAD65基因导入组PD模型鼠行为与对照组相比得到明显的改善（n=12，由〈0．01）．     

Quox-1基因同源序列在豚鼠精子形成中的表达

以地高辛标记的 Ｑｕｏｘ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的ｃ３ 片段为探针,与豚鼠基因组 Ｄ Ｎ Ａ 作 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交,结果表明,在豚鼠基因组中存在 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列以抗 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白的特异性抗体对成年豚鼠睾丸、附睾和幼年豚鼠睾丸的组织切片进行免疫组织化学分析,发现在豚鼠精子发生中精子细胞分化为精子阶段有类 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白表达,提示 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列可能对豚鼠精子发生中的精子形成过程有调控作用     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.