脐血贴壁细胞饲养层支持造血干/祖细胞扩增的初步研究

探讨来自脐血的贴壁细胞的特征及其对脐血造血干/祖细胞体外扩增的支持作用.利用流式细胞术对脐血中培养出的贴壁细胞进行了鉴定,同时观察其形态学特征,并由此建立细胞饲养层;在饲养层基础上建立共培养体系,分别体外扩增单个核细胞和CD34+细胞,观察饲养层对体外扩增的影响,并检测扩增后细胞的GEMM-CFC形成潜能.结果表明,脐血贴壁细胞呈纤维状,其CD14阳性细胞仅3.8%,而CD13、CD166、CD29阳性细胞分别为51.8%、35.6%、16.5%;与仅用外源细胞因子的非共培养体系相比,用饲养层加外源细胞因子建立的共培养体系中的单个核细胞和CD34+细胞扩增效率分别提高了2.09倍和2.94倍,并且前者扩增出的细胞比后者具有更高的GEMM-CFC形成潜能.可初步推定,从脐血中培养出的纤维状贴壁细胞具有骨髓间充质干细胞的特性.在适当的条件下,可以形成饲养层细胞,为造血干/祖细胞体外扩增提供支持基质细胞.
     

大鼠胚脑细胞玻璃化冷冻保存研究

在20 C室温下,用玻璃化冻存液(含5.5 mol/L乙二醇和1 mol/L蔗糖)对大鼠胚脑细胞进行一步法和两步法深低温保存.在冻存1、3、7、15 d后,37 C水浴快速复温,洗脱冻存保护剂,检测细胞活性.结果表明:两步法0.5 min平衡组,在玻璃化冻存15 d后,胚脑细胞的存活率和SDH活性分别为(78.6±3.3)%和0.69±0.05,细胞活性水平最高.此外,一步法1 min平衡组,冻存15 d后,细胞活性也较高,细胞存活率和SDH活性分别为(77.9±4.7)%和0.68±0.04.冻存后的胚脑细胞培养15 d后,生长良好并能伸出突起与相邻的神经细胞建立联系.     

人原始生殖细胞的分离和体外培养

从4～10周龄药物流产胚胎的生殖嵴和肠系膜组织中分离原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),培养在添加人重组白血病抑制因子(rh LIF)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(rh bFGF)和Forskolin的小鼠饲养层细胞上.经过4～7 d培养,PGCs形成典型的鸟巢状集落.集落在传代过程中保持碱性磷酸酶活性,且胚胎阶段性特异抗原1(SSEA-1)、胚胎阶段性特异抗原3(SSEA-3)免疫荧光染色呈阳性.具有分化潜能的PGCs能在体外连续传代培养12代.结果表明从药物流产胚胎中分离的人类PGCs可以在体外培养成为具有分化潜能的多能性干细胞.     

人淋巴细胞在低温保存过程中超微结构的变化

在液氮内冻存的人外周血淋巴细胞,当冻存介质内不含低温保护剂时,细胞内呈现大量冰腔,细胞质、细胞核、细胞器和生物膜结构发生严重破坏.细胞的结冰是造成细胞死亡和功能丧失的初始原因.当冻存在含有10％二甲基亚砜或甘油的介质内,40天时,绝大部分淋巴细胞具有完好的超微结构,少量细胞遭受冷冻损伤,主要表现在细胞器.如线粒体膨胀、(?)结构破坏等.冻存一年时,部分细胞的细胞核形状和结构也发生了深刻的变化,如细胞核分叶,核膜呈锯齿状皱缩,染色质分布不匀等.     

顺铂对肝癌SMMC-7721干细胞标志物的影响

目的探讨顺铂(cisplatin,DDP)对肝癌SMMC-7721细胞增殖、周期和干细胞标志物ABCG2、CD133及ICAM-1蛋白的影响.方法不同浓度(32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L)DDP作用于SMMC-7721,采用MTT比色法测定细胞增殖能力;PI染色后流式细胞仪检测细胞周期;免疫荧光法检测三种干细胞标志物表达水平.结果不同浓度DPP均对SMMC-7721细胞增殖产生抑制作用(P0.05).4 mg/L和2 mg/L DPP作用48 h使处于G0/G1期SMMC-7721细胞明显减少,S期细胞显著增多(P0.05).DPP作用后残存细胞中三种干细胞标志物(ABCG2、CD133及ICAM-1)表达增多.结论 DPP抑制SMMC-7721细胞增殖,阻滞细胞于S期.提示可能存在逃避DPP作用的肿瘤干细胞,为有效降低临床肿瘤复发率提供一定的理论基础.     

玻璃化冻存对胚胎神经细胞活性及脊髓移植的影响

采用玻璃化冻存技术对大鼠胚胎神经细胞进行深低温保存,在冻存1d、10d、20d和40d后,38℃水浴快速复温,离心洗脱冷冻保护剂,检测胚胎神经细胞的活性与功能,并移植于脊髓损伤大鼠.实验结果表明：玻璃化冻存40d的胚胎神经细胞,存活率为76.4±8.3％,膜完整性为冻存前的69.4±7.8％.细胞活力虽有下降,但仍可维持较高水平.培养1周的部分神经元建立突触联系,移植于脊髓损伤大鼠仍有一定的修复作用.     

骨髓间充质干细胞与造血干细胞共培养对脐血造血干细胞扩增的作用

脐带血造血干细胞的异体移植对高剂量化疗的患者恢复造血功能是一种有效的细胞学疗法，脐带血造血干细胞的体外扩增能提高有效植入的造血干／祖细胞的数量，将扩增10d造血干／祖细胞移植给高剂量化疗的成人患者，患者平均约在移植后的第26天（第15－45天）达到了嗜中性粒细胞的植入，为了加快有核细胞数量的扩增和嗜中性粒细胞的成熟，在以骨髓间充质干细胞的培养基质细胞层，采取阶段扩增方法培养单个核细胞和分选的CD34^ 细胞，并与无骨髓间充质干细胞的培养体系进行对照，从冻存的脐带血中分离的单个核细胞和CD34^＋细胞分别在含有骨髓间充质干细胞的100mL培养袋中用50mL ADM培养液培养7d,7d后收获细胞并移入含有1L ADM培养液的1L培养袋中继续培养7d，每天计数细胞量，14d后收获细胞，并进行相应的细胞分析，扩增的结果表明，在有骨髓间充质干细胞的共培养体系中，单个核细胞培养的有机细胞扩增了346倍，CD34^ 细胞培养的有核细胞扩增了674倍，无骨髓间充质干细胞的非共培养体系中，两者分别扩增了152倍和377倍，两种培养体系都获得了定向祖细胞（GM－CFC）和原始祖细胞（HPP－CFC）的扩增，有骨髓间充质干细胞的共培养体系获得了更多的嗜中性粒细胞。     

高效建立129S1/SvImJ 小鼠胚胎干细胞方法的探讨

选取超排后129S1/SvImJ品系小鼠的优质囊胚,使用辐照后冻存复苏的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,对比高浓度酶短时间消化法和低浓度酶长时间消化法,以0.25%胰酶-0.04%EDTA高浓度酶短时间消化法高效建立了4株小鼠胚胎干细胞系,建系率为36.31%.碱性磷酸酶,核型分析,体外分化和体内分化能力以及小鼠胚胎干细胞表面特异性分子标志0ct-4和Nanog的检测等表明,4个ES细胞系均为典型的小鼠胚胎干细胞系.所建立的ES细胞系为大规模培养ES细胞,进行后续的实验建立了理想的材料平台.     

玻璃化冻存对胚胎神经细胞活性及脊髓移植的影响

采用玻璃化冻存技术对大鼠胚胎神经细胞进行深低温保存,在冻存１ｄ、１０ｄ、２０ｄ和４０ｄ后,３８℃水浴快速复温,离心洗脱冷冻保护剂,检测胚胎神经细胞的活性与功能,并移植于脊髓损伤大鼠．实验结果表明：玻璃化冻存４０ｄ的胚胎神经细胞,存活率为７６．４±８．３％,膜完整性为冻存前的６９．４±７．８％．细胞活力虽有下降,但仍可维持较高水平．培养１周的部分神经元建立突触联系,移植于脊髓损伤大鼠仍有一定的修复作用     

银鲳脾脏和肾脏组织细胞体外培养研究

为探究银鲳脾脏和肾脏组织细胞体外培养条件, 本研究采用组织块培养法对银鲳脾脏和肾脏组织进行原代培养. 实验选用DMEM/F-12、M199和DMEM等作为基础培养基, 在其中分别添加体积分数为10％、15％、20％的胎牛血清, 并添加青链霉素及庆大霉素以防细菌污染. 结果表明: 银鲳脾脏和肾脏组织在胎牛血清体积分数为20％的DMEM/F-12培养基中贴壁最好, 迁出细胞的种类最多, 细胞生长速度最快. 其中脾脏组织共迁出6种不同的细胞, 分别为: 免疫细胞、基质细胞、上皮样细胞、成纤维样细胞、造血灶和未知细胞; 肾脏组织共迁出3种细胞, 分别为: 上皮样细胞、巨噬细胞和成纤维样细胞.