高效液相色谱在生物医药研究中的应用第三讲蛋白质的反相高效液相色谱分离

近十年来,高效液相色谱(HPLC)在蛋白质分离纯化方面取得了很大的进展,并得到了广泛的应用。HPLC包括排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱、疏水反应色谱以及反相色谱等,几乎已在蛋白质分离各种传统方法中得到应用。这些方法在蛋白质分离中各有其地位,但到目前为止人们普遍认为反相高效液相色谱(RP-HPLC是分离纯化蛋白质的最有效的方法     

离子交换法分离乳酸

本文在对多种吸附剂和离子交换树脂进行筛选的基础上，获得了一种对乳酸具有优良吸附性能的弱碱型离子交换树脂，测定了乳酸在该树脂上的离子交换平衡数据，建立了数学模型，研究了其它无机盐的存在对离子交换平衡的影响，同时测量了乳酸在该树脂上的交换速率和穿透曲线．上述研究对于乳酸分离，特别是从稀溶液中分离乳酸提供了一种新的方法，对其它有机酸的分离也具有参考意义．     

翻译后修饰蛋白质组学分离方法的研究进展

蛋白质翻译后修饰（PTMs）是调节细胞内生理活动的重要途径。该文总结了近年来PTMs蛋白质组学相关的分离方法,包括反相（RP）色谱法、离子交换（IEX）色谱法、亲水相互作用色谱（HILIC）法、多孔石墨化碳（PGC）色谱法、毛细管电泳（CE）法及分子筛色谱（SEC）法等。这些新方法为磷酸化、乙酰化、糖基化等PTM肽段或蛋白质的鉴定提供了更高的分离度和灵敏度。此外,该文也介绍了蛋白质领域其他重要分离方法的研究进展,这些方法可能被进一步应用于PTMs蛋白质组学的研究中。     

《离子交换平衡及动力学》一书出版发行

由兰州大学陶祖贻教授等人编著的《离子交换平衡及动力学》一书作为高等学校的试用教材,最近由原子能出版社出版发行。离子交换反应的理论主要包括研究交换平衡的热力学和研究交换反应速度的动力学。应该说,描述离子交换平衡的最合适也是最严格的方法是热力学,目前,离子交换反应的热力学研究已经取得了很大成绩,已经从二元离子交换体系发展到三元及多元体系,从     

凝胶过滤/离子交换全二维液相色谱系统的构建与评价

基于蛋白质的尺寸及带电性质,将凝胶过滤色谱(GFC)与离子交换色谱(IEC)两种分离模式结合,采用双捕集柱接口构建了GFC/2×IEC二维液相色谱(2-D LC)分离系统,同时考虑离子交换色谱分离蛋白质对等电点范围的限制,进一步结合中心切割平行柱的方法实现对蛋白质的全二维分离。为与后续蛋白质在线酶解、多肽分离及质谱鉴定匹配,系统中采用常规柱以保证蛋白质质谱鉴定对样品量的要求,3种常规分离柱分别选用凝胶过滤色谱柱TSK-GEL G3000SW_(XL)(300 mm×7.8 mm,5μm)、强阴离子交换色谱柱Hypersil SAX(100 mm×4.6 mm,10μm)和强阳离子交换色谱柱Hypersil SCX(100 mm×4.6 mm,10μm)。最终以酵母细胞蛋白质提取液为样品,对构建的二维系统加以评价,在总蛋白质浓度13.5 mg/mL、上样体积100μL的条件下,将第一维分离等时间切割17次,并将切割馏分全部导入第二维继续分离,二维系统在148 min内获得的总峰容量达到884。说明所构建的系统可以用于蛋白质的在线全二维分离。     

钠型斜发沸石在K^＋-Na^＋-NH4^＋和K^＋-Na^＋-Ca^2＋水溶液体系中的离子交换平衡

研究了K -Na -NH4 和K -Na -Ca2 水溶液体系与钠型斜发沸石的离子交换平衡。分别测定出以上两个体系在25℃、50℃和75℃下的离子交换平衡数据,利用平面三角图绘制表达出三元离子交换平衡等温线,并计算出沸石对体系中离子的分离因数。结果表明,在K -Na -NH4 溶液体系中,K 的分离因数在3以上,NH4 的分离因数在1~3之间,Na 的分离因数小于1,斜发沸石的离子交换选择顺序是K >NH4 >Na ,且低温有利于K 的交换,高温时NH4 的交换能力增强;在K -Na -Ca2 溶液体系中,K 的分离因数大于8,Na 的分离因数在1左右,Ca2 分离因数小于1,沸石的离子交换选择顺序是K >Na >Ca2 ,其中Ca2 属于部分交换,Ca2 对沸石对K 的交换选择性影响不大,且低温有利于沸石对K 的交换。     

以交联聚乙烯醇为载体的离子交换剂对蛋白质的分离性能

本文对阴离子交换剂ＤＥＡ—ＰＶＴ常压液相离子交换色谱分离蛋白质的性能、分离条件进行了探讨。结果表明其对蛋白质的分离性能良好，容易洗脱。与载体交联聚乙烯醇相比，ＤＥＡ—ＰＶＴ对蛋白质的非特异性吸附明显降低。     

离线pH梯度-强阳离子交换色谱法分离肽段混合物

复杂肽段混合物的有效分离是高覆盖率地鉴定蛋白质混合物的前提。Shotgun蛋白质组学研究通常采用二维液相色谱(强阳离子交换色谱-反相色谱)分离后接串联质谱检测的方法。但由于离子交换色谱体系中含有高浓度的盐,使得在线分析的难度较大;而在离线分析时,也常因需要对高盐组分进行脱盐处理而易引起样品损失。因此,该文尝试用pH梯度替代盐梯度,实现pH梯度-强阳离子交换色谱方法应用于复杂肽段混合物的分离。通过对缓冲体系pH值的计算,优化了乙酸-乙酸铵体系线性pH梯度配合盐梯度的离子交换色谱方法,以及柠檬酸-氨水体系线性pH梯度的离子交换色谱方法。将这两种方法应用于牛血清白蛋白酶切产物的分离取得了与常规强阳离子交换色谱相似的分离效果。乙酸-乙酸铵体系采用的是低浓度的可挥发性铵盐,采用真空冻干的方法可以有效除盐,基质辅助激光解吸质谱靶上自然挥发也可以达到较好的脱盐效果,简化了常规方法繁琐费时的脱盐步骤及避免了由此造成的样品损失。柠檬酸-氨水体系采用pH梯度洗脱替代盐梯度洗脱,大大降低了体系中的盐浓度。这两种方法在复杂体系蛋白质组研究的样本预分离中具有较好的应用前景。     

从酵母细胞中分离纯化醇脱氢酶

醇脱氢酶(ADH)用于食品工业，还是酶法测定乙醇或乙醛含量的工具酶。沉淀法和层析法至今仍然广泛用于分离蛋白质和酶。用离子交换层析、亲和层析等方法经过4～5个纯化步骤后，分离纯化ADH和其它蛋白质，纯化倍数可达100多倍。我们从酵母细胞中分离出醇脱氢酶，并通过硫酸铵分段盐析、凝胶层析以及离子交换层析对该酶进行纯化，用较少的步骤得到了相对高的纯化倍数。     

生物化学中应用的离子交换介质简介

一、前言以间歇操作及色谱操作的离子交换技术是生物化学中重要的分离方法之一。与凝胶渗透法、分配色层法、亲和层析及电泳柱等方法相比,离子交换技术最主要的优点是具有较高的交换吸附容量及分离容量。自八十年代以来离子交换色谱得到高速发展,已工业规模用于分离、纯化产品~([1,2])。     

用2D Micro-HPLC/MS分析六种蛋白质混合物的胰蛋白酶解多肽产物

采用2D Micro-HPLC系统,用MS对六种蛋白质的胰蛋白酶解多肽产物进行了分析,实现了蛋白质的高灵敏度、高分离度的检测。结合离子交换色谱法和反相毛细管色谱法,利用六个捕集柱和脱盐系统,可对各种分离条件进行优化。因此,可以实现对多种痕量酶解多肽的分离检测。该系统是痕量蛋白质和未知蛋白质检测的有力工具,结合高性能质谱仪,可以达到非常高的灵敏度。     

分离蛋白质的高效离子交换色谱填料的研究(Ⅲ)──膦酸基阳离子交换色谱填料的性能

分离蛋白质的高效离子交换色谱填料的研究（Ⅲ）──膦酸基阳离子交换色谱填料的性能常建华（西北大学化学系,西安,７１００６９）关键词填料,高效阳离子交换色谱,性能,蛋白质以磷羟基为离子交换基团的色谱填料是一类中强阳离子交换色谱填料,以前报道的此类填料是使...     

无孔单分散离子交换硅胶键合相用于蛋白质的高效液相色谱分离

将新合成的无孔硅胶二乙基氨基新型离子交换填料 (NPS-DEA)用于蛋白质的液相色谱分离。考察了流动相的pH值、盐浓度、流速及梯度程序对蛋白质分离的影响 ,并考察了蛋白质的质量回收率。实验结果表明 ,所得阴离子交换固定相的色谱性能良好。在梯度淋洗条件下 ,卵清蛋白、牛血清蛋白、胰岛素、γ-球蛋白、核糖核酸酶、溶菌酶获得了较好的分离。蛋白质的保留符合一般的保留值规律。柱填充床稳定 ,而柱负载较小 ,可用于高纯度的微量制备。     

凝胶层析和离子交换层析结合法纯化高盐发酵液中谷氨酰胺转胺酶

采用凝胶层析和离子交换层析相结合的方法分离纯化高盐培养基中的谷氨酰胺转胺酶,优化的凝胶层析的条件,上样量6mL,流速为0.25 mL/min;离子交换层析的上样量50 mL,流速为3 mL/min.酶被纯化了4.22倍,比活力达17.33 U/mg蛋白,回收率为77.5％.液相色谱-串联质谱鉴定、蛋白质数据库比对结果表明,纯酶与AAN01353是同种蛋白质.     

混合色谱填料的研究进展

随着科学技术的发展,人们需要分离分析的样品越来越复杂,尤其是多肽、蛋白质类生物样品的复杂性使得单一模式色谱难以满足分离分析的要求。混合模式色谱因其独特的分离性能,可以在一次分离中获得与多维色谱相当的分离效果,而且可以避免多维色谱系统结构复杂、流动相兼容性差、分析时间长等问题,成为近年来的研究热点之一。混合模式色谱的研究重点是色谱固定相的设计与开发。混合模式色谱固定相包括反相/离子交换混合固定相、反相/亲水混合固定相、亲水/离子交换混合固定相、两性离子交换混合固定相及三相混合固定相。本文综述了近年来混合模式色谱填料的研究及应用进展,并对混合模式色谱及固定相的发展前景进行了展望。     

盐析色层

色层分离中应用离子交换树脂作为固定相以分离或纯化各种物质的方法,简便而有效,且能分离性质非常相近的物质。近来已成为一个化学的单元操作而获得广泛的应用。离子交换树脂在色层分离中作为固定相而加以应用的可概括为三:(1)离子交换色层(ion exchange chromatogra-phy),是以离子交换树脂为固定相,用电解质溶液(酸、碱或中性盐)为淋洗剂,分离二种或更多种的电解质混合物,如碱金属、希土元素、卤素离子及超铀元素等。(2)离子排斥的方法(ion exclusion),是以离子交换树脂为固定相,用水为淋洗剂,分离电解质与非电解质的混合物。这种方法广泛地用以纯化各种有机物质如葡萄糖、甘油等。(3)盐析色层(salting-out chromatography),是以离子交换树脂为固定相,不同浓度的盐溶液为淋洗剂,分离二种或多种的水溶性非电解质混合物。     

疏水层析蛋白质动力学与平衡过程的考察

疏水层析是分离生物大分子的常用技术之一，但对疏水层析中蛋白质吸附动力学和平衡过程的研究并不多见．本文对蛋白质疏水吸附动力学和平衡过程作了基本假设，并用实验进行了验证。制备了两种不同丁基密度的疏水琼脂糖介质，用其吸附牛血清白蛋白(BSA)以验证对疏水吸附动力学与平衡过程作的假设，考察了盐浓度及配基密度对蛋白质疏水吸附的影响．还对三种疏水性不同的蛋白质：核糖核酸酶、卵清蛋白和牛血清白蛋白的混合体系进行了分离性能的研究，获得了满意的分离效果．实验表明，蛋白质在疏水介质上的吸附动力学和平衡过程与所作假设相符，在实验条件下等温吸附线符合Langmuir吸附等温方程：研制的丁基琼脂糖疏水介质具有优良的使用性能。     

蒲黄多糖的研究

蒲黄经热水提取,脱除蛋白质、乙醇沉淀,Sephadex G50柱层析分离,DEAE-Sephadex A25和DEAE-Cellulose离子交换柱层析分离得3种白色粉末状多糖TAA、TAB、TAC。经凝胶柱层析、醋酸纤维素薄膜电泳证明,三者为均一体。3种多糖经酸全水解、纸层析和气相色谱分析,确定了糖基的组成及摩尔组成比。用核磁共振、甲基化分析、NaIO_4氧化等方法对多糖结构进行了初步探讨。     

高岭土原位晶化产品及全合成Y型沸石的稀土离子交换平衡

本文测定了钠式高岭土原位晶化产品及全合成Ｙ型沸石与稀土离子铽Ｔｂ（Ⅲ）的离子交换等温线和平衡数据，采用了三种不同的热力学方法处理平衡数据，求得该离子交换反应Ｎａ→Ｔｂ的选择系数、修正选择系数、热力学平衡常数以及标准自由能、热焓、熵的改变量。对这两种离子交换剂的结果及三种热力学处理方法进行了对比及讨论。     

高岭土原位晶化产品及全合成Y型沸石的稀土离子的交换平衡

本文测定了钠式高岭土原位晶化产品及全合成Ｙ型沸石与稀土离子铽Ｔｂ（Ⅲ）的离子交换等温线和平衡数据，采用了三种不同的热力学方法处理平衡数据，求得该离子交换反应Ｎｄ→Ｔｂ的选择系数、修正选择系数、热力学平衡常数以及标准自由能、热焓、熵的改变量。对这种离子交换剂的结果及三种热力学处理方法进行了对比及讨论。