新城疫病毒HB 92株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)无毒耐热株(HB92株)M基因，将其克隆于pGEM-T载体，并进行了序列测定和分析．结果显示，测定的M基因长1223个核苷酸。包含一个1095个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸．与已报道的10株NDVM基因比较，核苷酸同源性为88．4％～95．8％，氨基酸同源性为89．8％～95．3％。HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高(达95．8％)．NDVM蛋白分子中有9对碱性氨基酸。在多肽的第117～120位有一个含4个氨基酸CKKS的特征性结构．这些结果为揭示NDV HB92株的分子生物学背景，了解NDV的分子进化和遗传变异机理，进而开发利用HB92株奠定了基础，也为将NDV另列为副粘病毒亚科的一个新属提供了理论支持．     

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株BamHI-Ⅰ片段的核苷酸序列分析

对在朝鲜首次分离得到的棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株(HaSNPV-KO)基因组BamHI-Ⅰ片段的全序列进行了测序与分析．该片段全长1．895kb．包括p26基因．p10基因及p74基因的3′末端序列．p26基因位于户10基因的上游．排列方向与p10基因相同，该基因的编码区大小为803bp，编码267个氨基酸，p10基因的编码区大小为261bp，编码87个氨基酸．p74基因的排列方向与p10和p26基因相反．棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株与棉铃虫核型多角体病毒中国株(HaSNPV-g4株)的p26基因序列的同源性为99．8％，两个分离株的p10基因序列完全相同，而p74基因3′末端序列的结果有99．4％的同源性．朝鲜株与美洲株(HzSNPV)的p26和p10基因序列的同源性分别为98．8％，98．7％，而p74基因3′末端序列有97．9％的同源性．     

新疆伊吾湖嗜盐菌bop基因多样性

为了研究新疆中部地区伊吾湖嗜盐微生物和细菌视蛋白基因（bop）资源，分离纯化了95株嗜盐和耐盐菌．并从中挑选了10株红色的菌株，采用PCR和TA克隆的方法，扩增出bop基因螺旋C到螺旋G的核心序列，测定了基因的核苷酸序列．基于bop基因序列的同源性比较和系统发育学分析，发现9个序列分布在同一分支下，表明伊吾湖嗜盐菌bop基因具有一定的多样性和明显的自身地域性．     

蓝舌病毒HbC3株S7基因5’非编码区序列分析

根据已发表的蓝舌病毒(bluetongue virus．BTV)10型标准株S7基因设计合成一对与其5'-NCR(noncoding region)序列同源的引物．经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HbC3株和10型标准株长度分别为277bp和290bp的S7基因5’非编码区cDNA片段．以建立起dsRNA体外扩增系统．将扩增的BTV-HbC3毒株的S7基因5’非编码区片段通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中．用PCR技术和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pUCm-T-BTV-HbC3-S7．通过核苷酸序列分析方法分别将2个毒株的S7基因5’非编码区与呼肠孤病毒-3(reovirus-3)型比对。发现BTV-HbC3株与呼肠孤病毒-3 L2基因5’非编码区基因具有完全的同源性．将BTV-HbC3毒株接种在不同细胞系如猴肾传代细胞(Vero)、人肝癌细胞(Hep-3B)和小鼠成纤维细胞(L929)等细胞株上，比较BTV-HbC3在不同种系细胞上的增殖特征，并且用双向免疫扩散试验证实BTV-HbC3和BTV-10型之间的血清学关系．结合本实验室的研究结果提示BTV-HbC3株可能是蓝舌病毒的一个新的基因型．     

猪瘟病毒HCLV株E_2核苷酸序列与结构分析

用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ技术从 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｈ Ｃ Ｌ Ｖ 株 Ｆ４８２ 代感染兔脾的细胞总 Ｒ Ｎ Ａ 中分段扩增出了 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｅ２ 基因特异的３ 个部分重叠的 Ｄ Ｎ Ａ 片段（大小分别为 ４９９ ｂｐ、５７２ ｂｐ 和 ２４５ ｂｐ）,并将之分别克隆到ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｔ 载体上 经核苷酸序列测定和片段重叠完成了包含 Ｅ２ 全长基因的 １ １４４ ｂｐ 序列的测定,其 Ｇ Ｃ含量为４９．０％ ：核苷酸序列与国外报道的各株病毒的 Ｅ２ 基因同源性分别为８３．５％ ～９７．５％ ;其推导的氨基酸序列的同源性也分别为８９．３％～９６．２％ ,变异主要分布在 Ｅ２ 蛋白的 Ｎ 半部分     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

嗜盐古菌Haloterrigena thermotolerans JCM 11050Tbop基因序列研究

对标准菌株Haloterrigena thermotolerans JCM 11050^T，其编码螺旋C至螺旋G的细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR）蛋白基因（bop基因）片断采用PCR方法进行了扩增，TA克隆并测定了其核苷酸序列．对翻译出的氨基酸序列进行亲水性分析，表明该菌株的BR蛋白与已报道相应序列具有类似的二级结构．蛋白序列聚合比对结果表明，该菌株BR蛋白与Natrinema属的BR蛋白具有一定相似性．在这一Haloterrigena属的标准菌株中证实bop基因，进一步丰富了bop基因资源．     

嗜盐古菌中氯视紫红质基因序列的遗传分析

采用PCR方法扩增了嗜盐古菌AB19、AB30和AJ5编码螺旋C至螺旋G的氯视紫红质（halorhodopsin，HR）蛋白基因片断和168rRNA基因（168rDNA），测定了它们的核苷酸序列，与已报道的，hr基因序列差异显著．获得AJ5 HR蛋白基因序列在Halobiforma属中尚属首次．对hr基因序列进行的遗传分析，包括GC含量、转换与颠换的比值、密码子使用偏好，表明hr基因面临进化选择和偏倚突变压的双重制约，是一类进化程度较高的基因．对比br基因编码蛋白螺旋C到G的序列发现它们具有相似的种属特征．采用BR和HR蛋白螺旋C到G序列构建系统发生树比传统的168rDNA序列具有优势，BR和HR可以作为两种新型的分子指标．     

家猫ACE2基因克隆、测序及生物信息学分析

本研究从家猫组织中扩增并鉴定血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）基因，为阐明SARS相关冠状病毒（SARS-CoV）感染家猫的机制提供理沧依据．从家猫肺脏中提取总RNA，以Oligo dT-Adaptor为引物合成第一链cDNA，根据人及小鼠的ACE2基因mRNA序列设计系列引物，通过聚合酶链式反应，分段扩增出家猫ACE2基因的编码区的特异性片段并测序鉴定．家猫ACE2基因mRNA编码区共包括2418个核什酸，推测编码蛋白含805个氨基酸残基．其氨基酸序列与人、小鼠、大鼠ACE2氨基酸序列的同源性分别达到85％，81％和81%．利用多种生物信息学工具软件对家猫ACE2蛋白的理化及生物学性质进行分析．比较人、家猫、果子狸、小鼠、大鼠等ACE2序列中与SARS-CoV结合有关的3个功能区，发现家猫ACE2与人ACE2的同源性最高，提示家猫ACE2在SARS病毒跨种感染中可能发挥重要作用．     

粘虫核型多角体病毒pdv-e66基因的序列测定及比较研究

测定了ＬｓＮＰＶｐｄｖ－ｅ６６基因１８９６ｂｐ序列，与其它杆状病毒ｐｄｖ－ｅ６６基因进行了同源性比较，其与ＡｃＮＰＶｐｄｖ－ｅ６６基因核苷酸同源性为５１．９％，氨基酸同源性为３８．８％，分析指出，ＬｓＮＰＶｐｄｖ－ｅ６６基因中有５个高度保守区和一个ＮＴＳ．５端具有典型的晚期基因启动子特征．     

黄鳝DEAD-box家族PL10基因的克隆与序列分析

通过PCR克隆的方法，从黄鳝(Monopterus albus)中得到两个PL10基因的cDNA片段Mo PL10A和Mo PL10B，长度均为1．127kb，推测其编码375个氨基酸的蛋白片段．结合其他PL10类同源物序列，对这两条cDNA进行了分析和初步的功能推测．根据此片段的氨基酸序列构建的系统发育树与形态分类结果一致．在不同组织中的RT—PCR结果表明Mo PL10A和Mo PL10B的mRNA在各组织中的分布有差异．     

稀有鮈鲫（Rare gudgeon）Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物，采用PCR技术在稀有鮈鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增，发现3个大小分别为220、700和1500bp的片段，经过克隆和测序分析，从220bp的片段中获得两个基因片段，证明为稀有鮈鲫的Sox1和Sox21基因片段，无性别差异，其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1：80．4％和97％；Sox21：77．3％和9l％，其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox：96％和98％；Sox21：88％和100％，显示了其高度的保守性．此外，从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克降的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据．通过对这些数据进行序列比对及策类树的构建，分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式，对稀有鮈鲫的性别决定进行了探讨，为Sox基因的进化研究提供分子基础．     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

水稻高温、干旱响应基因OsHdr5的克隆与表达谱分析

低温、高温、干旱等非生物逆境通常会严重影响到水稻的生长及产量.为深入了解水稻逆境反应的分子机理和挖掘耐逆相关基因,本文采用Affymetrix水稻表达芯片对水稻多逆境下的全基因组表达谱进行分析,并筛选出众多表达特异基因.OsHdr5是其中一个在多个生长发育时期与组织器官中受高温、干旱诱导均显著上调的基因,用实时定量PCR方法(real-time PCR)对其表达水平进一步分析,两组结果基本吻合.用PCR方法扩增获得长为743bp的全长基因序列,其ORF区编码167个氨基酸残基,组成的肽链含有磷酸化激酶位点,形成的二级结构包含一个由6个α螺旋和2个β折叠组成的跨膜结构域,进一步分析推测其可能是叶绿体膜上与细胞跨膜信号传递相关的功能蛋白.     

猪瘟病毒RT-PCR产物的T载体克隆、测序及同源比较

利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶的无模板延伸活性制备了可直接克隆ＰＣＲ产物的Ｔ载体，并成功地对猪瘟病毒ＨＣＬＶ株的ＲＴ－ＰＣＲ产物进行了克隆．ＤＮＡ序列测定和同源性分析表明该ＲＴ－ＰＣＲ产物是猪瘟病毒特异的，与已知序列的猪瘟病毒毒株的序列同源性均高达９６．７％～９８．７％．ＨＣＬＶ株与Ｃ株具有相同的起源，但序列比较发现它们既有共同的点突变，也有序列上的差异，表明这两株病毒在各自独立的传代过程中已发生了各不相同的遗传性变异，值得进一步比较研究．     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

紫红链霉菌2917磷脂酶A2基因的克隆及序列分析

用探针从紫红链霉菌2917基因组文库中克隆出磷脂酶A3基因，经双向测序，确定了其基因的全序列，并由此推导出其氮基酸序列，将此序列与其他来源的磷脂酶A2基因序列进行了比较研究，结果显示，与天蓝色链霉菌A3（2）中磷脂酶A2的同源性为98％，与蛇毒的磷脂酶A2的同源性小于10％，但有类似的质子传递系统、Ca^2 结合环以及疏水通道等结构，这个基因的克隆为磷脂酶A2结构与功能的研究提供更多的信息，也为利用重组微生物生产磷脂酶A2打下了基础。     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

一株鸭细小病毒的分离鉴定与ns基因序列分析

采用余姚某鸭场濒死鸭肝组织悬液，接种鸭胚尿囊腔增殖病毒，蔗糖梯度离心法纯化病毒，电镜观察见直径约20nm的球形病毒粒子，免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒（duck parvovirus，DPV）抗血清有明显沉淀线；SDS-PAGE电泳可见3条结构蛋白带，与DPV毒株一敛；参照GenBank DPVns基因序列979～1566bp设计引物，PCR扩增反应获得其目的片段．克隆到载体pMD18-T后测序，该序列与GenBank中的番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）以及巴比里鸭细小病毒（Barbarie duck parvovirus，BDPV）的ns基因序列同源性为98％．病鸭肝组织匀浆液雏鸭感染试验显示雏鸭发病症状及剖解病理变化明显，死亡率为75％．利用血清学实验与鸭肝炎Ⅰ型、禽流感和新城疫病毒感染举别．由此确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV，命名为04NY株．