HIV-1外膜蛋白在毕赤酵母中的构建

为了进一步研究HIV-1外膜蛋白的结构和功能,获得足够量的糖蛋白,对HIV-1的外膜蛋白Env进行了修饰,利用PCR技术克隆目的基因,把Env基因构建到毕赤酵母Pichia pastoris表达载体中,把pPICZαB-Env表达载体转化到酵母中,根据基因重组技术,使Env基因和酵母基因组重组,筛选阳性重组子.     

人心钠素在酵母细胞中的合成与分泌

将化学合成的人α心钠素基因插入酵母分泌表达载体YFD18,然后把重组质粒转化进酵母菌Y33.用放射免疫分析测得酵母转化子表达心钠素的水平约为700μg/1,其中有99％以上在培养液中.对纯化产物的N末端分析表明人α心钠素的前4个氨基酸残基被缺失了.     

新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验

以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础, 通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A, SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41, 线性化后, 采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中, 经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子. 摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明, 目的蛋白得到良好表达, 表达量最高可达到47.9 mg/L. 目的蛋白经初步纯化后, 用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究, 结果显示, 目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应, 并可介导特异的CTL反应, 对靶细胞具有明显的杀伤活性, 表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂.     

SARS病毒核衣壳蛋白的表达与鉴定

依据Genebank中SARS基因组序列和酵母菌对密码子的选择性,采用人工合成的方法,合成了优化的SARS病毒核衣壳蛋白(N)的全基因(1296bp),与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建成重组表达载体pPIC9K-N.重组载体转化毕赤酵母GS115,并经MD平板和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115-pPIC9K-N.用甲醇诱导其分泌表达目的蛋白并对表达产物进行分析、浓缩与鉴定.结果表明,SARS病毒核衣壳蛋白能实现在毕赤酵母中高效表达,表达量达到20%,初步纯化后的产物具有良好的抗原特异性.     

酵母高稳定载体的构建及人-αA干扰素在酵母中的高表达和分泌

本文利用酿酒酵母天然2μm质粒的SnaBI位点与pEMBL Yi27质粒的SmaI位点经平末端连接,构建成酿酒酵母高稳定质粒载体pHC11,经测定表明,其酵母转化子在非选择培养条件下连续生长50世代后,仍有82％的细胞保留该质粒,此结果证实了2μm质粒中非功能区的存在,将人-αA干扰素基因表达分泌单元插入pHC11,构建成重组质粒转化酵母后,在完全培养基中发酵培养,经分析测定,培养上清液中表达产物占总蛋白量的36.8％,干扰素效价达2.6×10~(10)u/L,表明利用高稳定载体pHC11使人-αA干扰素在酵母中得到了高表达和分泌。     

人参皂苷β-葡萄糖苷酶基因的毕赤酵母载体构建及生物转化

将人参皂苷β-葡萄糖苷酶(Glu GF)基因与表达载体p PIC9K连接,构建重组质粒,转化至毕赤酵母中表达,并用于人参皂苷Rb1的催化转化.研究结果表明,成功构建了重组表达质粒p PIC9K-GluGF,转化后筛选到阳性重组毕赤酵母菌.重组菌产酶的最佳甲醇诱导体积为0. 5%,诱导时间为168 h.重组菌诱导培养制备的粗酶液具有Glu GF的活性,可以水解人参皂苷Rb1,产物中皂苷C-K含量达到0. 09 mg/mL,粗酶液中Glu GF的比活力为0. 67 U/mg.     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达和分泌

将黑曲霉葡萄糖淀粉酶GAI的cDNA插入到质粒pMA91的酵母PGK基因的启动子和终止序列之间,构成含葡萄糖淀粉酶基因的表达载体pMAG69。用原生质体转化法引入酿酒酵母GRF18,实现黑曲霉葡萄糖淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达,利用基因本身的信号序列使99％以上的酶蛋白分泌至胞外,构建的酵母菌株在含10％淀粉的培养基中2天内能水解87％的淀粉,对酵母转化子的稳定性检测显示,重组质粒pMAG69可在酿酒酵母中较稳定地存在。     

重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.     

荧光碳点与CdTe量子点对毕赤酵母的毒性比较

以葡萄糖为碳源合成荧光碳点;以巯基琥珀酸为稳定剂,合成CdTe量子点。通过紫外吸收光谱和荧光发射光谱对二者的荧光性能进行表征。又以毕赤酵母作为指示生物,考察了延滞期的毕赤酵母分别与荧光碳点和量子点共培养后的生长曲线,并利用血球计数板法对培养至25h的毕赤酵母细胞进行计数。研究结果表明:荧光碳点对毕赤酵母的生长抑制作用不明显,即使在高浓度(14.4 mmol/L)下,也基本不影响毕赤酵母的生长;而CdTe量子点必须控制在很低的浓度(5.1μmol/L),才表现出低的细胞毒性。     

口蹄疫病毒3ABC基因截短体在毕赤酵母中的表达及鉴定

将长为525 bp的口蹄疫病毒3ABC基因截短体克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中, 构建了重组表达质粒pPIC9K-3ABCt. 用BglⅡ线性化后, 电转化毕赤酵母菌GS115, 经表型筛选, PCR鉴定, 获得阳性重组菌(GS115/pPIC9K-3ABCt). 然后进行诱导表达, 通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果表明, 重组菌株成功分泌表达了分子量为40000, 具有免疫反应活性, 且呈二聚体形式的目的蛋白. 在96 h时表达量达到最高峰, 占分泌总蛋白的18%, 达到23.4 mg/L. 为进一步研制口蹄疫免疫和感染动物鉴别诊断试剂奠定了基础.     

人CuZn-SOD的分子改造及在毕赤酵母中的表达

为了改善人CuZn-SOD的酶学性质, 在借鉴人细胞外超氧化物歧化酶的特性基础上, 利用分子生物学技术, 在人CuZn-SOD的C末端加入肝素亲和肽构建了人CuZn-SOD工程酶, 并在毕赤酵母中获得表达, 经纯化的工程酶具有较强的肝素亲和性.     

重组β-木糖苷酶转化人参皂苷Rb3及C-Mx

从Aspergillus niger NG1306菌株中扩增得到β-木糖苷酶基因anxyl, 与pPICZαA连接构建了表达载体pPICZαA-anxyl, 进一步在毕赤酵母KM71H中诱导表达获得了目的酶蛋白重组β-木糖苷酶(Anxyl); 并将其用于人参皂苷Rb₃及C-Mx的生物转化及催化动力学参数表征. 研究结果表明, Anxyl可将人参皂苷Rb₃和C-Mx分别转化为人参皂苷Rd和C-K. 酶学性质研究表明, 该酶最适反应pH=2.5, 最适反应温度为35 ℃; 在pH=2.0~5.0, 20和30 ℃条件下其具有较好的稳定性, Mg²⁺对酶活具有促进作用. Anxyl对葡萄糖和乙醇有较好的耐受性, 其催化对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNPX)、 人参皂苷Rb₃和C-Mx水解的米氏常数(K_m)值分别为3.1, 1.55和1.04 mmol/L, 酶的最大反应速率(V_max)分别为1.9×10², 0.8×10³和8×10³ mmol/min, 酶的转换数(K_cat)值分别为5.55, 0.17和1.85 s^-1, 表明该酶对天然底物Rb₃和C-Mx具有更高的亲和力.     

13C辅助的超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度

毕赤酵母作为一种高效的外源蛋白表达平台,其蛋白表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关.但胞内代谢物种类多、物化性质差异大、浓度低、周转快,对其绝对浓度的精确检测一直难于实现.本研究将超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用分析方法与13C同位素标记技术相结合,探索解决该难题的方法.首先,优化了超高效液相色谱的操作条件,利用3种色谱柱实现了64种常见中间代谢物的分离;对三重四极杆质谱仪的检测离子对和碰撞电压等操作条件进行优化,找到了对各种物质具有专一性的检测离子对.然后,利用全标记13C标记底物培养细胞,收集胞内的全标记代谢物用作定量内标物,建立了53种中间代谢物的标准曲线.实验结果表明,本方法不但精确性高,标准曲线相关系数达到0.99以上,而且重现性好,受实验条件和仪器操作条件的影响很小.将本方法应用于毕赤酵母胞内代谢物浓度的绝对定量分析,成功获得了胞内各种代谢物的浓度水平,为后续深入研究毕赤酵母代谢调控机理,实现外源蛋白的高效生产奠定了基础.     

α-因子指导下β-hCG在酵母中的合成和分泌

本文利用酵母接合因子α基因(MFα-1)的启动子、前导肽顺序(α-factor leader sequence)以及2μm质粒复制起始顺序(2μori)构建了一组酵母-大肠杆菌穿梭分泌型表达载体(pYNA,pYNB)。将人绒毛膜促性腺激素β-亚单位(β-hCG)基因(145肽顺序)融合于这一前导肽顺序的3′端,在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得到表达和产物分泌。表达产物与天然β-hCG全抗体及单克隆抗体都有免疫反应。用β-hCG放射免疫双抗试剂盒测到每升培养物含有45μg产物。对这一产物的部分特性做了初步鉴定。     

肠道病毒71型外壳蛋白VP2在Pichia.pastoris酵母中的表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法,克隆肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)SHZH03株外壳蛋白VP2基因,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP2,经序列测定证实α-factor信号肽和VP2的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导筛选到高效表达VP2蛋白的工程菌株.用饱和硫酸铵法对重组蛋白VP2进行了较好的纯化.Western Blot分析表明,重组蛋白VP2具有较好的反应原性,从而为发展EV71快速、高效、廉价诊断试剂奠定了基础.     

毕赤酵母表达的HIV-2外膜糖蛋白的纯化与活性测定

人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是艾滋病（AIDS）的病原体,其外膜蛋白是HIV侵入人体靶细胞的物质基础,对其结构与功能的深入研究不但能为彻底揭示HIV致病机理奠定基础,而且有助于抗感染免疫研究和治疗物的设计^[1,2],HIV－2ROD外膜蛋白gp105是一种高度糖基化的糖蛋白,近年来发展迅速的毕赤酵母（Pichia Pastoris）真核表达系统对分泌蛋白的糖基化修饰形式与天然的gp105相同^[3]。为实现大量制备有活性的gp105,我们用PCR法去除了gp105基因5′端28个密码子的非功能片段,以提高gp105的表达水平,并成功地在毕赤酵母中实现了gp105的高效分泌表达。本文对这一表面产物的纯化、性质及活性进行了研究,为尽快研制出有效的疫苗奠定基础。     

利用Ty片段构建高稳定的整合型酵母菌表达载体

本文提出了一种利用酵母转座子Ty因子的新战略.本文中构建的酵母整合型质粒含有TyH25片段,利用这一片段与染色体之间的同源重组,可把质粒上的目的基因带入染色体,并可获得相当稳定的表达.本文还报道了GAL4基因和CUP1基因的稳定表达.脉冲梯度电场电泳(PFGE)揭示,质粒上的同一基因可以整合到不同的染色体上.Southern杂交分析表明,质粒整合的靶位点具有较高的结构相似性;整合后的质粒可以以单拷贝形式,也可以成串排列的多拷贝形式存在.我们还发现,随着整合情况的不同,质粒中同一目的基因在不同转化子中表达的情况也不尽相同.     

一种新的氨基酸描述子及其在肽QSAR中的应用

从天然氨基酸的25个结构与拓扑变量中经主成分分析得到一种新的氨基酸描述子——VSTV （principal component scores vector of structural and topological variables）.应用该描述子对以下3个体系,即血管紧张素转化酶抑制剂（2肽）、抗菌18肽和促凝血酶原激酶抑制剂（6～12肽）进行分子结构参数化表达,并在此基础上通过偏最小二乘回归(PLSR)建立定量构效关系(QSAR)模型,取得了优于文献的结果.模型的复相关系数（R2）和交互检验复相关系数（Q2）分别为0.789, 0.767; 0.996, 0.879; 0.981, 0.480.     

地衣杆菌α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达

利用酵母MF-α1因子的启动子和信号序列构建载体并将缺失了启动子和信号序列的地衣杆菌α-淀粉酶基因重组进该载体上信号序列的下游,组建含α-淀粉酶基因的表达载体,经校正读码框架后实现α-淀粉酶基因在酿酒酵母中的表达和产物的分泌;比较了酵母分泌的酶与在枯草杆菌中表达产生的酶的某些性质;讨论了基因表达和分泌的机制。     

转基因水稻植株再生及外源人α-干扰素cDNA的表达

本文使用转化脂介导转化法(Lipofectin-mediated transformation)成功地将含有人α-干扰素(Hu-α-IFN)cDNA以及与其连锁的新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)基因的E. coli质粒pIG3031导入到水稻(indica type rice)的原生质体内,并由此获得转化愈伤组织。基于Npt-Ⅱ酶活性的测定结果表明转化频率高达10％。筛选出的转化愈伤组织在分化培养基上再生出了完整的籼稻转基因植株。Southern杂交分析证明,外源Hu-α-IFN cDNA己整合到水稻基因组内;RNA条带杂交结果显示,外源Hu-α-IFN cDNA在T-DNA转录子1启动子(P1′)的控制下,在转化水稻细胞中有效地进行了转录;体外生物活性检测表明,转化植株组织抽提物中含有干扰素特有的抗病毒活性,说明外源Hu-α-IFN cDNA可在水稻细胞内正确表达。