人参皂苷β-葡萄糖苷酶基因的毕赤酵母载体构建及生物转化

将人参皂苷β-葡萄糖苷酶(Glu GF)基因与表达载体p PIC9K连接,构建重组质粒,转化至毕赤酵母中表达,并用于人参皂苷Rb1的催化转化.研究结果表明,成功构建了重组表达质粒p PIC9K-GluGF,转化后筛选到阳性重组毕赤酵母菌.重组菌产酶的最佳甲醇诱导体积为0. 5%,诱导时间为168 h.重组菌诱导培养制备的粗酶液具有Glu GF的活性,可以水解人参皂苷Rb1,产物中皂苷C-K含量达到0. 09 mg/mL,粗酶液中Glu GF的比活力为0. 67 U/mg.     

枯草杆菌信号肽酶Ⅰ的识别序列特异性和信号肽在蛋白质分泌中的作用

本文采用重组体DNA技术使质粒pUB110的β-蛋白质的N-末端编码区与B.licheniformis的α-淀粉酶结构基因融合并产生了信号肽酶Ⅰ识别切割区,从而构建了带有β-信号肽的β AMY基因。该基因借助β-蛋白的可译读码和β-信号肽表达并分泌到胞外,分泌效率约为野生型的10％,通过对不同pβAMY质粒分泌能力的比较、限制性内切酶切点分析和β-信号肽介导下的胞外α-淀粉酶分子量的比较,in vivo证明了B.subtilis信号肽酶Ⅰ的特异识别切割序列为Ala—Ala—Ala Ala,结果还表明B.licheniformis α-淀粉酶在B.subtilis中的分泌作用符合翻译后加工模式。     

不对称还原制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的双酶共表达重组菌的构建

克隆了来自于枯草芽孢杆菌的羰基还原酶基因IolS和葡萄糖脱氢酶基因GDH,采用Ni-NTA镍亲和层析柱对重组蛋白IolS进行纯化,并对纯酶进行了酶学性质研究.结果表明,该羰基还原酶的最适温度和pH值分别为30oC和6.0;在40oC以下具有较好的热稳定性;在pH5.57.0的偏酸性范围内能保持75%以上的酶活.采用三种策略构建了IolS和GDH的共表达重组质粒,结果发现,采用双启动子的重组质粒能够实现羰基还原酶IolS的高效表达,粗酶液中的IolS和GDH的比酶活均达到1.5U/mg.运用该重组菌对10g/L的OPBE进行不对称还原,反应15h后,底物转化率大于99%,产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的ee值达到99.5%.     

苏芸金杆菌蜡螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp. galleriae)(H5ab)δ-内毒素基因的克隆和表达

本文通过分子杂交得到阳性克隆FG2,带有8.5kb的Barn HI和Sal I插入片段,经western blot分析表明此重组子表达了130kD和68kD的δ-内毒素蛋白,能与HD-1的δ-内毒素抗血清反应,同时对2—3龄的玉米螟进行了生物活性测定,证明有毒杀活力。本工作首次报道了苏芸金杆菌蜡螟亚种(H5ab)的δ-内毒素基因在大肠杆菌中的克隆和表达,同时为δ-内毒素基因在130Md质粒上的定位提供了直接证据。     

催化Aldol加成反应的新型枯草芽孢杆菌BS168酰基氨肽酶的表达和应用

从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组中的ORF32230出发,通过氨基酸序列分析推测其可能为酰基氨肽酶基因,并与典型的脯氨酸寡肽酶家族成员一致,含有2个独立的结构域,活性中心由催化三联体丝氨酸-天冬氨酸-组氨酸(Ser-Asp-His)组成.将BSU32230的基因片段与p ET-21a载体相连,转入BLP(DE3)表达菌中,在0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在及20℃条件下诱导表达该蛋白.利用硫酸铵沉淀与Ni亲和层析对BSU32230蛋白进行纯化,并通过实验证明该蛋白同时具有酯酶和肽酶2种活性.该酶最佳反应温度为50℃,最佳p H值为8.0,40℃下半衰期约29 h,在p H=4~10范围内稳定.该酶能够在有机相中催化不对称Aldol加成反应,且反应产物的立体选择性较好(84.6%).     

二茂铁接枝聚丙烯酰胺水溶液的流变行为研究

采用“Post-Modification”技术在二甲基亚砜中直接对聚丙烯酰胺进行烷基化反应,接枝二茂铁官能团(Fc),制备出一种具有氧化还原性质的二茂铁改性聚丙烯酰胺(PAM-Fc).通过红外光谱(FTIR)、核磁氢谱(1H-NMR)、热失重(TGA)、电化学、动态流变测试等方法对PAM-Fc的化学结构、电化学活性和流变特性进行了表征.研究结果表明,PAM-Fc具有氧化还原性,相比PAM呈现更好的热稳定性,这主要源于Fc基团稳定了PAM分子链的自由基.Fc基团在水溶液中的疏水缔合作用会导致体系黏度显著增大.通过添加NaCl、β-环糊精或H2O2等可以对PAM-Fc水溶液的黏度进行有效调控.其中,NaCl可以屏蔽PAM-Fc分子链上的电荷,β-环糊精能够包合Fc基团,H2O2则可将疏水的还原态Fc基团氧化成亲水的氧化态Fc,从而实现PAM-Fc水溶液流变行为的调节.     

重组HEV衣壳蛋白截短体的表达及鉴定

戊型肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染引起的肠道病毒性传染病. HEV是一种无囊膜的单股正链RNA病毒, 其编码区由3个开放阅读框(ORF)组成, 属戊型肝炎病毒科. HEV衣壳蛋白由ORF2编码. 本研究根据编码HEV ORF2 aa382~aa674的核苷酸序列克隆了p293基因, 并将其克隆入原核表达载体pET28a, 利用大肠杆菌BL21(DE3)对HEV衣壳蛋白截短体(p293)进行了表达. SDS-PAGE和Western blot检测结果表明, 在优化的表达条件下(1 mmol/L IPTG, 250 r/min, 37℃, 5 h), 重组蛋白p293能够在大肠杆菌内有效表达, 目的蛋白约占总蛋白的66.15%. TEM检测结果显示, 原核表达的p293能够在体外形成约30~40 nm的病毒样颗粒. 免疫印迹和免疫荧光检测结果表明, p293与HEV标准阳性血清具有良好的反应原性和反应特异性. 实验结果表明, p293可应用于HEV宿主吸附和病毒装配研究, 为HEV的预防与诊断研究奠定了基础.     

苯并咪唑并氮杂糖的结构修饰及其β-葡萄糖苷酶抑制活性

源于D-核糖的苯并咪唑并氮杂糖1和2具有良好的β-葡萄糖糖苷酶抑制活性,对其苯环部位结构修饰,通过Mitsunobu反应合成了30个新型苯环不同位置上含单取代基的苯并咪唑并氮杂糖稠合三环衍生物11a～11g, 12a～12g,13a～13h和14a～14h.测试了新合成化合物对β-葡萄糖糖苷酶(杏仁)的抑制活性.结果显示,化合物13e和13f与14f的混合物对β-葡萄糖糖苷酶(杏仁)表现出优越的酶抑制活性, IC50值分别为0.49和0.25μmol/L,活性高于阳性对照米格列醇的酶抑制活性.构效分析表明,稠合三环氮杂糖中的六元氮杂糖环形式有利于此类苯并咪唑并氮杂糖三环衍生物的β-葡萄糖苷酶抑制活性.苯环上3'或4'位连有给电基团,如甲基、甲氧基等,将极大地促进化合物的酶抑制活性.     

基于短肽自组装与共组装的纳米纤维人工水解酶

将水解酶活性中心催化三联体氨基酸(His/Ser/Asp)引入9-芴亚甲氧羰基苯丙氨酸二肽(Fmoc-FF)双亲短肽序列中,利用短肽的自组装性能,构建了具有对硝基苯酚乙酸酯水解活性的超分子纳米纤维人工水解酶.研究结果表明,形成规则的纳米纤维结构是获得催化活性的必要条件.9-芴亚甲氧羰基(Fmoc)基团间的弱相互作用促使β-折叠二级结构的形成.通过对比天然水解酶的米氏动力学方程、最适催化温度及p H结果可知,所制备的超分子纳米纤维人工水解酶具有与天然酶相似的酶学性质.金属离子Ca2+和Ba2+对人工水解酶活性具有激活作用,而Mg2+,Ni2+,Co2+,Cu2+和Zn2+则抑制酶活性.     

基于特异性蛋白Gαa的比浊法检测β-葡聚糖

通过基因重组技术,克隆表达了β-葡聚糖特异性结合美洲鲎G因子α亚基片段a(Gαa)蛋白,并建立了β-葡聚糖比浊检测方法。克隆的Gαa基因相对分子质量为40000(1251 bp),浓度为2 g/L,纯度达到98%以上。该蛋白能与βG特异性结合,紫外分光光度计在340 nm下检测的吸光度与βG含量呈正线性相关,线性范围3.125~200 mg/L,R2=0.997,检测限3.125 mg/L。结合力实验表明,该蛋白与βG具有良好的亲和性及特异性。该方法具有成本低、快速、专一性强等特点。     

3-磷酸甘油醛脱氢酶与酵母线粒体基因组维持蛋白Mgm101的相互作用

采用酵母双杂交方法, 以Mgm101p为诱饵, 筛选酵母cDNA文库. 分离鉴定15个与Mgm101p相互作用的蛋白因子, 其中5个阳性克隆均为GPD1编码的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH). 克隆了GPD1在 S. cerevisiae的同系物ScTDH2基因, 进行绿色荧光蛋白GFP标记、 亚细胞组分分离和蛋白质印迹分析, 结果表明, GAPDH除了在细胞质为糖酵解酶的主要作用外, 可能为多功能蛋白, 在酵母线粒体中与Mgm101p相互作用参与线粒体DNA维持的生物过程.     

重组人OCIF结构域D1～D6基因在毕赤酵母中的表达

利用PCR以实验室构建的原核重组表达质粒pProEX-OCIF为模板扩增得到N末端融合有6×His标签和rTEV蛋白酶识别序列的人破骨细胞形成抑制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryFactor,简称OCIF)结构域D1～D6(简称O CIFm)编码基因片段;将其与pMD18-T连接,转化大肠杆菌TOP10,筛选得到阳性重组质粒pMD18-OCIFm,双酶切重组克隆质粒pMD18-OCIFm得到OCIFm基因片段;将其定向插入甲醇营养型酵母分泌表达载体pPIC9中,构建获得重组表达质粒pPIC9-OCIFm.测序验证后,以限制性内切酶SalⅠ线化,电穿孔转化酵母宿主菌GS115.筛选得到阳性表达菌株后,甲醇诱导表达4d,SDS-PAGE和Westernblot对表达情况进行分析和确认.所获得的OCIFm基因片段在甲醇营养型酵母中表达量占菌体总蛋白的30%以上.利用Ni-NTA树脂对表达产物进行一步亲和层析纯化.活性测定表明纯化的表达产物可诱导体外培养的成熟破骨细胞样细胞的凋亡.表达产物的生物学活性较利用原核表达系统明显提高.     

半合成人肿瘤坏死因子cDNA的构建及其在大肠杆菌中的高表达

本文报道从人基因文库中分离淋巴毒素(LT)基因的同时,克隆了肿瘤坏死因子(TNF)基因,这两个基因相距1.2kb.TNF基因有4个外显子,第4外显子编码TNF成熟蛋白157个氨基酸中的140个.将第4外显子切出一部分,再人工合成编码其余氨基酸的DNA片段,两者连接构成重组的人TNF(rhTNF)cDNA,并克隆在大肠杆菌表达载体中成功地得到表达.5 l罐发酵得菌体约20g/l,以L929为靶细胞测定细胞毒活性为10~6-10~7单位/ml.高压液相色谱仪分离纯化rhTNF,冻干后得白色粉剂.测定了这种rhTNF的氨基端的10个氨基酸序列,证明与天然的人TNF完全相同.纯度约为95％.     

以β-半乳糖苷酶为标记选出高效表达乙型肝炎病毒表面抗原的天坛株重组痘苗病毒

我们从天坛株痘苗病毒的基因组中,分离编码11K及25K蛋白的双向转录启动子,以胸苦激酶(TK)基因为旁侧序列,插入到质粒pAT153中,构建成可以同时表达两个外源基因的载体质粒,并将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因及大肠杆菌的β-半乳糖苦酶(LacZ)基因,插入该载体质粒,使它们分别在11K及25K启动子钠控制下,构建成共表达质粒。用钙沉淀法将此质粒DNA同天坛株痘苗病毒在细胞内进行同源重组,在含X-gal的培养基挑蓝色蚀斑,简便、准确地选出重组痘苗病毒。所选到的重组痘苗病毒高效表达了HBsAg。我们还把上述重组痘苗病毒接种动物,观察了它们的毒力及免疫原性。     

α-氨基酸及其酯化物侧链对其β-环糊精复合物稳定常数的影响

为了探索α-氨基酸及其酯化物的侧链R基团对其与环糊精非共价复合物结合强度的影响,将一定摩尔比的β-环糊精(β-CD)分别与L型正缬氨酸(n-Val)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、天冬氨酸(Asp)、天冬氨酸-4-苄酯(Asp-4-benzyl ester)和天冬氨酸-4-叔丁酯(Asp-4-t-butyl ester)在室温下混合,反应平衡后采用电喷雾电离质谱进行竞争反应检测,并以改进的质谱滴定结合曲线拟合法计算结合常数.结果表明,它们均可形成摩尔比为1∶1的非共价复合物.在2组竞争反应中,复合物的结合强度顺序分别为[β-CD∶Asp-4-benzyl ester+H]~+[β-CD∶Asp-4-t-butyl ester+H]~+[β-CD∶Asp+H]~+以及[β-CD∶Phe+H]~+[β-CD∶Leu+H]~+[β-CD∶n-Val+H]~+.质谱滴定曲线拟合法测得[β-CD∶n-Val+H]~+,[β-CD∶Asp+H]~+,[β-CD∶Asp-4-t-butyl ester+H]~+,[β-CD∶Asp-4-benzyl ester+H]~+,[β-CD∶Leu+H]~+和[β-CD∶Phe+H]~+的稳定常数(lgK_(st))分别为1.81,2.54,3.14,3.26,3.36和3.67,结合强度依次增强.竞争反应的定性分析结果与质谱滴定定量法测得结合强度结果的趋势一致.由于所选用的α-氨基酸及其酯化物客体的羧基端(—COOH)和氨基端(—NH_2)均相同,且都为亲水基团,仅有侧链R基团不同,因此在溶液中客体分子受疏水驱动与β-CD主体靠近并结合时,侧链R基团的疏水力和极性2个因素起重要作用.由于客体分子体积小,其碳端的羧基还可与β-CD大口或小口边缘的羟基形成氢键,使复合物更加稳定.     

羰基还原酶CR2重组酶体系不对称合成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺

构建了羰基还原酶CR2重组酶体系,并优化了相关的酶促催化反应条件.通过在催化体系中添加辅酶NADP+(0.1 mmol/L)和辅底物葡萄糖(120 g/L),在30℃及p H=8.0的条件下反应4 h,CR2重组酶体系不对称还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺(DKTP,10 g/L),合成了高光学纯度(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺[(S)-DHTP,e.e.值99.9%],产率为62%.在酶促催化过程中,由于辅酶循环生成葡萄糖酸导致反应体系p H值下降而影响催化效率.通过调控反应体系p H值,(S)-DHTP的产率提高到68%.不同浓度底物的反应过程表明底物对CR2酶促反应具有抑制作用,且在10 g/L底物浓度下反应的时空产率可达1.3 g·L-1·h-1.     

HIV-1嵌合抗原的纯化及免疫原性分析

为获得高效的HIV诊断试剂,选定HIV-1的外膜蛋白env中469-511aa,538-674aa和700-734aa3处包含较多抗原位点的区域作为免疫抗原,用PCR的方法从HIV-1全基因扩增编码这3处片段的基因序列,将它们克隆到原核表达载体中,利用大肠杆菌表达系统表达嵌合蛋白.结果发现,3段嵌合基因能在大肠杆菌BL21(Star)中表达,通过Ni-sepharose4B金属Ni螯合层析柱分离纯化目的产物,酶联免疫检测结果表明,纯化抗原有较强的抗原特异性.     

C70-β-丙氨酸衍生物抗氧化性的研究

在非均相碱性体系中,合成了C70-β-丙氨酸衍生物.采用FT-IR和1H NMR手段对其结构进行了表征,并考察了它对超氧阴离子清除能力、羟基自由基清除能力、还原能力及金属螯合能力.结果表明:C70-β-丙氨酸衍生物具有良好的抗氧化活性,并且β-丙氨酸在四个体系中并未表现出抗氧化活性,说明C70-β-丙氨酸衍生物的抗氧化能力可能主要来自于C70上的双键.     

我国人乳头瘤病毒6型新变种基因组克隆及L1晚期结构基因在大肠杆菌中表达

本文从一例中国妇女外阴尖锐湿疣组织标本中提取DNA,BamHI酶切,以pAT153为载体,成功地克隆了我国人乳头瘤病毒6型(HPV-6BV)基因组.经South-ern杂交,酶谱及部分DNA序列分析,发现该克隆的HPV6基因组有明显变异,可视为我国发现的第一个HPV6的新变种.本文进一步分离了HPV6BV的L1基因,以pUR288为载体,在大肠杆菌中表达了β-半乳糖苷酶/HPV6BVL1N融合蛋白.经免疫转印试验证明,它既能与β-半乳糖苷酶抗血清反应,又能与HPV抗体反应,具有融合前各自的抗体亲和活性.该蛋白可用作诊断试剂及流行病学研究.     

氯霉素包合物的拉曼光谱研究

通过拉曼光谱法研究氯霉素与β-环糊精相互作用形成包合物的过程,探讨拉曼光谱作为一种新的验证包合物形成方法的可行性.采用饱和水溶液法制备氯霉素包合物,共聚焦拉曼光谱仪分别检测氯霉素、β-环糊精、氯霉素与β环糊精的物理混合物、氯霉素包合物的拉曼光谱并对照分析.结果表明,拉曼光谱法可说明氯霉素的苯环结构和易水解基团二氯乙酰胺...