临床肝素类药物酶解分析二糖组成

肝素是一类结构复杂的高分子糖类,以N-硫酸、6-O硫酸氨基葡萄糖和2-O硫酸艾杜糖醛酸为主要成分组成二糖。常见的肝素注射液是以未分级肝素为原料纯化灭菌制备而来,在临床上使用更为广泛的是将肝素降解得到的低分子片段,低分子肝素保留了肝素糖链基本结构,但是不同制备工艺导致其具有不同的还原及非还原端。本研究以肝素类药物为研究对象,使用肝素裂解酶玉,域及芋将肝素注射液、低分子肝素注射液(达肝素、那屈肝素、依诺肝素)、化学合成的类肝素(磺达肝素)进行酶催化降解产生二糖,结合强阴离子交换色谱( Strong anion exchange high performance liquid chromatography,SAX-HPLC)以及紫外检测器在线分析,使用市售肝素二糖标准品确定各种二糖结构。此外,使用反向离子对色谱和电喷雾质谱联用分析磺达肝素中的甲基二糖以及达肝素和那屈肝素中的脱氨二糖结构,为肝素以及类肝素药物的质量控制提供更为精确的结构信息。     

毛细管电泳法测定肝素和低分子量肝素平均硫酸化程度

肝素和低分子量肝素（LMWHs）作为临床上常用的抗凝血药物,其抗凝血活性与硫酸化程度（SD）密切相关。然而,肝素类药物的生产需经历一系列复杂的工艺过程,在制备和储存过程中,肝素的硫酸基团容易水解丢失,影响抗凝血活性,这将直接影响肝素药物的使用安全性。为保证产品质量,需要发展一种快速检测肝素硫酸化程度的技术,以监测原料质量和工艺条件的稳定性。虽然已有一些测定肝素硫酸化程度的报道,但这些方法均有局限性,不适用于肝素生产的质量控制。为此,开发了一种基于毛细管电泳技术（CE）检测肝素和低分子量肝素的平均硫酸化程度的方法。首先,用肝素酶混合液彻底消化未分级肝素（UHF）和低分子量肝素,然后用毛细管电泳分离酶解得到的所有寡糖和二糖构建模块,并对它们进行定性和定量分析。随后,根据每种寡糖和二糖的峰面积及其硫酸酯基团的数量,便可计算出每个构成肝素二糖单元硫酸化程度的平均值。使用该方法对来自两个生产商各4个批次依诺肝素（低分子量肝素）和5个批次肝素原料进行检测,并计算了各批次样品的相对标准偏差（RSD）,对不同厂家生产的依诺肝素平均硫酸化程度进行了比较,验证了该方法的实用性。该方法灵敏度高,准确可靠,分析速度快,在肝素类药物生产过程的质量控制中具有良好的应用潜力。     

低分子量硫酸化多糖的体积排阻色谱法分离及其组成定量分析

建立了用于分离并定量测定低分子量硫酸化多糖中不同糖链数的各个组分分布比例的体积排阻色谱方法。系统考察了流动相的组成、离子强度和pH值、流速、柱温等因素对分离的影响。最佳分离条件: 两支TSK-GEL G2000 SWxl色谱柱(300 mm×7.8 mm)串联,流动相100 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 7.0),流速0.5 mL/min,柱温35 ℃,进样量5 μL,样品质量浓度10 g/L。在最佳的分离条件下,可以将低分子量硫酸化多糖样品中不同糖链数的各个组分分离并对各个组分的分布进行了定量分析。用该方法对美国药典标准品(USP)、商品和实验室制备的低分子量硫酸化多糖糖链数分布进行了定量化比较,证明该方法可用于低分子量硫酸化多糖类药物的组成成分的质量控制。     

含N-乙酰化肝素寡糖的制备及序列分析

建立了含N-乙酰化肝素寡糖的分离提纯及其序列结构分析方法.首先应用肝素酶Ⅰ深度酶解低分子量肝素来富集含N-乙酰化结构寡糖,通过Bio-Gel P10凝胶色谱法分离制备了包括二糖至十四糖的系列肝素寡糖粗样品,ProPac PA-1强阴离子高效液相色谱(SAX-HPLC)等方法对粗样品进一步分离,提纯得到4种六糖和3种八糖片段.其次应用肝素酶Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ复合酶解与HPLC法分析各纯化寡糖的二糖组分,并结合肝素酶Ⅰ底物特异性,初步推断4种六糖和3种八糖的序列结构.在寡糖的糖链两端均含有N-硫酸化二糖,而N-乙酰化二糖分布在糖链当中.应用电喷雾离子阱-飞行时间质谱(ESI-IT-TOF-MS)在负离子模式下进一步表征寡糖并分析其裂解规律.结果表明,各寡糖中均出现大量因SO32-丢失形成的碎片离子峰,六糖中主要有双电荷和三电荷碎片离子峰;在八糖中出现了一系列从双电荷至五电荷的离子峰.各寡糖的双电荷离子峰质荷比进一步确定了上述寡糖的序列结构.六糖的裂解规律表明,裂解主要存在于糖苷键,N-乙酰葡糖胺和糖醛酸上的裂解方式分别为0,2X和0,2Z.本研究提供了切实有效的分离、分析未知结构肝素寡糖序列的新方法.     

邻苯二甲酸为背景吸收电解质的毛细管电泳法测定低分子量肝素中的阴离子

在生产和贮存低分子量肝素的过程中,糖链上的硫酸酯基团会被水解而损失活性,因此肝素样品中常可以检测到游离的硫酸根离子,此外在生产过程中还会引入其他阴离子。为了检测低分子量肝素的质量稳定性,常用离子色谱检测低分子量肝素中游离的阴离子。但是相对分子质量较大的低分子量肝素会污染离子色谱柱和抑制器。为此发展了一种灵敏的毛细管电泳方法用于测定低分子量肝素中游离的SO~(2-)_4、Cl~-、F~-、PO~(3-)_4和OAc~-。不同于常用的背景吸收离子铬酸根,采用邻苯二甲酸根作为背景吸收电解质。与铬酸根相比,邻苯二甲酸根与所有待测阴离子电泳淌度匹配得更好,因此可以获得较窄的峰形。而且邻苯二甲酸根在230 nm检测波长下的摩尔吸光系数(4 754 L/(mol·cm))比铬酸根(254 nm,2 400 L/(mol·cm))高。因此,可以将毛细管电泳检测阴离子的灵敏度提高到与离子色谱法相当的水平。通过验证,该方法在0.002~1 mmol/L的浓度范围内具有较好的线性关系,日内(n=6)和日间(n=3)迁移时间和峰面积的相对标准偏差均小于3%。所测阴离子的检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为0.4~0.8μmol/L和2~4μmol/L。该方法可用于监测低分子量肝素的稳定性。     

肝素类寡糖合成研究进展

肝素(heparin,HP)和硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)家族中的一类线性硫酸化多糖,其结构复杂、牛物活性多样.为了深入研究其结构序列与小同生物活性之间的关系,近年来针对肝素类寡糖的合成与功能研究成为糖化学和糖牛物学研究的一个热点领域,涌现出一些新的合成方法与合成策略.选取了2001年以来国际上一些在肝素类寡糖的化学合成和酶法合成方面的代表性工作予以综述.     

茶多糖的纯化及结构分析

从茶多酚生产的下脚料中,通过有机溶剂洗涤和凝胶色谱分离,得到一种水溶性多糖.经高效液相色谱分析,为单一茶多糖,其相对分子量为(10～10.5)×105;气相色谱分析表明,糖基由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖组成,其摩尔比为6.97:5.34:8.11:2.76:1.14;比色法测其总糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量分别为90%、8.52%、27.65%.红外光谱和核磁共振分析表明,该多糖足由单糖通过β-糖苷键连接的,多糖链上络有糖醛酸、氨基或蛋白基团,同时含有α和β异头碳;x-衍射分析显示,随多糖纯度的提高,茶多糖更易结晶,且有不同的品体聚合物出现;DSC的分析表明,随茶多糖纯度的提高,热焓增加,峰温向高温漂移.     

高温~1H NMR鉴别8种海参硫酸软骨素

提取了8种海参中的粗多糖,经DEAE-52阴离子交换柱分离纯化得到其中的海参硫酸软骨素(SC-CHS),除日本刺参CHS外其余均为首次获得的海参多糖。对获得的SC-CHS进行分子量、单糖组成及硫酸基含量等基本性质分析后,利用高温1HNMR对SC-CHS结构进行初步鉴别。结果表明,高温条件下SC-CHS的1HNMR图谱具有较好的分辨度。对其支链硫酸化岩藻糖的异头氢进行归属和比较,并以此为指标鉴别不同种类海参硫酸软骨素的结构差异,建立了一种以海参硫酸软骨素结构特征为指标的海参指纹图谱;初步探讨了不同海域生长的海参中硫酸软骨素支链岩藻糖硫酸基的特点,比较发现:寒带海域海参的硫酸软骨素岩藻糖上硫酸基取代以2,4-di OSO3、3,4-di OSO3双取代为主,含部分4-OSO3单取代;温带海域海参以2,4-di OSO3双取代为主,含部分4-OSO3单硫酸基取代;热带亚热带海域海参以2,4-di OSO3双取代和4-OSO单取代为主。这将为海参构效关系的进一步分析鉴定提供理论依据。     

肝素非还原端饱和结构的紫外吸收研究及在肝素寡糖测序中的应用

为了进一步探讨非还原端饱和结构的肝素寡糖在UV 232 nm的吸收情况, 制备了4种饱和结构的肝素二糖, 并用离子对反相液相色谱/离子阱飞行时间质谱(RPIP-LC/MS-IT-TOF)光电二极管阵列检测器分析了它们在UV 232 nm的吸收情况. 分析结果表明, 饱和结构的肝素二糖在UV 232 nm的检出限为9 μg(S/N=10), UV 232 nm/UV 206 nm约为不饱和结构肝素二糖UV 232 nm的7%~40%. 结果还表明, 肝素二糖UV 232 nm的吸收强度受亚硫酸基团(SO₃^2?)影响较大. 另外, 通过比较不饱和结构的肝素/硫酸类肝素(Hep/HS)标样二糖发现, 含N-未取代葡萄糖胺(GlcNH₃⁺)基团的二糖在UV 232 nm的吸收值较低. 最后, 通过简单的UV检测方法, 结合 HNO₂(pH=4.0)裂解法和RPIP-LC/MS-IT-TOF分析, 简化了含GlcNH₃⁺肝素六糖的测序方法. 本研究为以后用 HNO₂(pH=1.5)裂解法对混合组分N-硫酸化的肝素寡糖结构序列分析提供了可能.     

一株抗氧化活性酵母菌产多糖的纯化与结构分析

研究了Pichia fermentans酵母菌产多糖YP5的单糖组成和结构。将酵母菌进行超声破碎后,采用乙醇沉淀法得到粗多糖,然后进行DEAE-纤维素色谱柱分离,得到均一的水溶性多糖YP5。经气相色谱分析表明,糖基由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖与半乳糖组成,其摩尔比为9.51∶1.33∶2.31∶0.94∶84.93∶0.96。乌氏粘度计法测得多糖的分子量为8.3×104。结合红外光谱和核磁共振1HNMR分析表明,该多糖YP5具有多糖特征性的红外吸收峰,存在酰胺结构,主要由β-D-葡聚糖组成。     

Recent advances in mass spectrometry analysis of low molecular weight heparins

Low molecular weight heparins (LMWHs) are the most widely used anticoagulant drugs produced by chemical or enzymatic modification of parent heparin polysaccharides. The present article reviews recent advances in orthogonal and complementary mass spectrometry (MS) methodologies towards complete elucidation of natural and modified structures in LMWHs that possibly affect the drug quality, safety and efficacy.     

定量结构―活性相关性在药物空间结构研究中的应用

定量构效关系研究是目前国际上一个比较活跃的领域。定量结构―活性相关性(QSAR)在新药研制中的研究方法包括取代基多参数法(Hansch法)、比较分子力场分析法(CoMFA)等。QSAR在癌症、AIDS等药物研制方面取得良好的成果,为药物研究开拓了新的领域。构建癌症药物理想的QSAR模型,为设计活性更高的抗癌化合物提供了理论指导,QSAR在新药结构设计方面具有良好的研究前景。     

二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法解析替考拉宁杂质

建立了二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱法（2D-UPLC-Q/TOF-MS）对替考拉宁组分分离和杂质结构解析的分析方法,有效地解决了流动相中含不挥发性磷酸盐的色谱系统不适用于液相色谱-质谱快速鉴定替考拉宁杂质的难题。一维超高效液相色谱以Octadecyl silica （ODS） hypersil色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）进行色谱分离,以3.0 g/L磷酸二氢钠溶液（pH 6.0）/乙腈=9/1 （v/v）为流动相A、3.0 g/L磷酸二氢钠溶液（pH 6.0）/乙腈=3/7 （v/v）为流动相B进行梯度洗脱;二维超高效液相色谱以Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（50 mm×2.1 mm, 1.7 μm）进行脱盐,以0.01 mol/L甲酸铵（pH 6.0）和乙腈为流动相进行梯度脱盐洗脱。质谱在电喷雾离子源、正离子模式下,采用全信息串联质谱（MS^E）模式采集质谱数据,锥孔气流速50 L/h,锥孔电压60 V,离子源温度120 ℃,雾化气流速900 L/h,雾化气温度500 ℃,毛细管电压2500 V,碰撞能量20~50 eV。根据杂质精确质量数及其二级质谱信息推导其结构,并对替考拉宁主要成分TA_2-2的裂解规律进行了推导,发现了2个母核特征离子;对《欧洲药典》10.0收录的10个组分及22个杂质组分进行二级质谱分析,发现了3个新杂质组分。采用该法既可以使用一维超高效液相色谱根据相对保留时间进行组分准确定位,也可以使用二维超高效液相色谱-四极杆/飞行时间质谱二级质谱信息快速、简便、灵敏地对杂质进行结构鉴定,为替考拉宁的质量控制和工艺优化提供了一种新思路。     

非水毛细管电泳法同时测定消毒剂、个人护理品及药膏中三氯生、三氯卡班和对氯间二甲苯酚

三氯生（TCS）、三氯卡班（TCC）和对氯间二甲苯酚（PCMX）这3种消毒有效成分因广谱杀菌而广泛应用于消毒剂、个人护理品及药品中。为监督这些产品质量、保障消毒效果,非常有必要建立同时分析这3种消毒有效成分的方法。鉴于此,该文以十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）为电渗流反转剂,建立了同时测定上述3种消毒有效成分的非水毛细管电泳-紫外检测新方法,并对分离缓冲体系及浓度、样品介质等条件进行了优化。结果表明,未涂层熔融石英毛细管（20.0 cm×50.0 μm,总长度30.2 cm）为分离毛细管,14 mmol/L硼砂、2 g/L聚乙二醇20000和0.5 mmol/L DTAB的甲醇溶液为分离缓冲溶液,样品介质为含5 g/L聚乙二醇20000的甲醇-乙腈（50∶50, v/v）,在214 nm下进行检测,实现了3种消毒有效成分的同时分离。在1~100 mg/L范围内,3种消毒有效成分的校正峰面积与质量浓度呈良好的线性关系,相关系数（r）均大于0.99。方法的检出限（LOD,信噪比为3）为0.2 mg/L,定量限（LOQ,信噪比为10）为1.0 mg/L;加标回收率在94.5%~104.4%范围内,相对标准偏差均小于4.8%。利用研究建立的新方法测定了消毒液、洗手液、婴儿爽身粉、抑菌乳膏共31件样品,并将结果与国家标准方法GB/T 27947-2020和GB/T 34856-2017中的液相色谱法结果相比较,无统计学显著性差异。与国标方法相比,方法极大地减少了有机溶剂消耗量。该法前处理简单,结果准确,非常适合实验室的常规分析。     

兔子朊蛋白结构稳定性的分子动力学研究(英文)

朊蛋白病是一种能够对人类和动物带来致命影响,并具有高度传染性的神经退行性疾病.兔子是目前已经报道的哺乳类动物中对朊蛋白病免疫的少数几个物种之一.我们将分子动力学和操控式分子动力学模拟相结合,研究了兔子正常朊蛋白的结构稳定性;同时讨论了蛋白结构的收敛性及刚性分布,并揭示了兔子朊蛋白中关键二级结构的动力学以及受力各向异性特征,证实了兔子朊蛋白结构的稳定性特征.     

易衍生化温敏高分子刷的制备及其温敏行为研究

温敏材料由于优异的性能和潜在的应用价值而具有良好的发展前景.利用超分子自组装单层(SAM)与表面引发聚合(SIP)技术将2-(2-甲氧乙氧基)甲基丙烯酸乙酯(MEO2MA)与聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA526)的共聚物poly(MEO2MAco-OEGMA526)接枝于金表面,探索了不同引发剂溶液浓度(χIsol)、单体OEGMA526摩尔浓度(C526)与干态膜厚度(d)对该高分子刷性质的影响.应用石英晶体微天平(QCM)对其温敏行为进行研究,结果表明:在χIsol=1%与C526=5%条件下制备的高分子刷,最低临界溶解温度(LCST)为34℃;其LCST由OEGMA526的单体摩尔浓度决定,不受膜厚的影响.该高分子刷在接枝生物素后其与链霉亲和素的结合实验证明,高分子刷末端的羟基为其官能团化提供了契机.该易衍生化温敏高分子刷为发展新型温敏材料提供了研究基础.     

大气有机物热脱附-全二维气相色谱-火焰离子化分析方法

全二维气相色谱（GC×GC）是20世纪90年代发展起来的具有高分辨率、高灵敏度、高峰容量等优势的分离技术,在我国将其用于大气挥发性有机物（VOCs）研究方面才刚刚起步.本文将GC-GC与氢火焰离子化检测器（FID）联用,构建了用于测量大气有机物的热脱附-全二维气相色谱-氢火焰离子化分析系统（TD-GC×GC-FID）.采用HP-5MS和HP-INNOWAX色谱柱,建立了C5-C15大气有机物分析方法,实现了一次分析过程同时分离非甲烷烃（NMHCs）、含氧挥发性有机物（OVOCs）和卤代烃等多种组分.利用标准物质和四级杆质谱（qMS）进行定性,外标法结合FID质量校正因子定量.目标物在GC-GC谱图中第一和第二维保留时间变化分别小于0.6s和0.02s,峰体积平均相对标准偏差为14.3%,其中烷烃和芳香烃为4.5%.标准曲线r2均值大于0.99,平均检出限为6.04ng,平均回收率为111%.利用该方法检测到2010年1月北京市区大气中400多种有机物（信噪比大于50）,鉴定了其中的103种物质,包括烷烃、烯烃、芳香烃、卤代烃、醛、酮、酯、醇和醚等.所测定有机物平均总浓度为51.3×10-9V/V,其中OVOCs约占51%,芳香烃约占30%,烷烃约占15%,卤代烃和烯烃分别占3%和1%.平均浓度最高的前3个组分是乙醇（9.84×10-9V/V）、丙酮（6.72×10-9V/V）和甲苯（3.48×10-9V/V）.     

固定化联吡啶钌电化学发光免疫分析研究进展

综述了固定化联吡啶钌[Ru(bpy)23+]电化学发光免疫传感技术的发展状况,介绍了近年来在电化学发光免疫传感领域出现的新型固相载体材料和固定方法,及其与其他分析技术联用方面的发展,并对其发展趋势进行了展望.指出电化学发光免疫分析技术在生物分子检测、药物分析及临床诊断中显示出强大的生命力.Ru(bpy)23+的电化学发光已引起广泛的关注.固定化Ru(bpy)23+电化学发光免疫分析体系具有线性范围宽、灵敏度高、装置简单、可控性强等优点,被广泛应用于分子生物学、化学、药学等领域.     

（S）-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺合成研究进展

西司他丁是目前临床上广泛使用的广谱抗菌药泰能的重要组分,（S）-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺是合成西司他丁的关键中间体,目前已有多种合成方法见诸文献.综述了近年来（S）-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的各种合成方法,对其进行了简要评述,并对今后的发展方向进行了展望.