质谱技术鉴定细胞中组蛋白翻译后修饰的研究进展*

组蛋白是真核细胞中构成染色质内核小体的主要元件,其翻译后修饰蕴藏着组蛋白密码,是表观遗传学的重要内容,影响染色质的结构和功能,进而调控基因表达。组蛋白翻译后修饰形式的鉴定是揭示组蛋白密码的关键,目前质谱技术已经成为分析组蛋白及其翻译后修饰的重要工具。本文综述了组蛋白翻译后修饰鉴定方法的新进展,介绍了基于质谱技术“bottom up”和“top down”的组蛋白分析策略,及CID、ECD和ETD等鉴定组蛋白修饰位点的质谱碎片裂解技术,并结合当前研究进展,评述了质谱技术在组蛋白翻译后修饰谱的鉴定、组蛋白各种变体的测定、以及在生理过程中组蛋白修饰丰度动态变化的定量分析等方面应用的新进展。     

基于ProteinGoggle 2.0的组蛋白H4蛋白质变体的自上而下表征（英文）

由于大量可能蛋白质变体以及每一个翻译后修饰大量可能位点的存在,核心组蛋白上密集的组合式翻译后修饰的自上而下表征一直是一个巨大的分析挑战。结合高分辨串级质谱,基于同位素质荷比和轮廓指纹比对的整体蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle 2.0在组蛋白翻译后修饰的自上而下鉴定方面拥有诸多独特的优势。该文报道ProteinGoggle 2.0对HeLa核心组蛋白H4的数据库搜索及蛋白质变体的鉴定结果。基于从UniProt网站下载的人类核心组蛋白H4的纯文本文件和"鸟枪法"注释,ProteinGoggle 2.0首先创建包含所有可能蛋白质变体的理论数据库;从纯文本文件中提取的信息主要是氨基酸序列、可能的翻译后修饰(单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和磷酸化)及氨基酸变异(A77→P)。在控制质谱水平假阳性率低于1%的前提下,共鉴定到426个蛋白质变体,这是目前为止H4蛋白质变体的最全报道。这些ProteinGoggle 2.0鉴定到的H4蛋白质变体也与之前报道的ProSightPC 2.0的鉴定结果进行了肩并肩比较。总而言之,ProteinGoggle 2.0可以对具有复杂组合修饰及氨基酸变异的蛋白质组进行数据库搜索和蛋白质变体鉴定。     

基于ProteinGoggle 2.0的组蛋白H4蛋白质变体的自上而下表征

由于大量可能蛋白质变体以及每一个翻译后修饰大量可能位点的存在,核心组蛋白上密集的组合式翻译后修饰的自上而下表征一直是一个巨大的分析挑战。结合高分辨串级质谱,基于同位素质荷比和轮廓指纹比对的整体蛋白质数据库搜索引擎ProteinGoggle 2.0在组蛋白翻译后修饰的自上而下鉴定方面拥有诸多独特的优势。该文报道ProteinGoggle 2.0对HeLa核心组蛋白H4的数据库搜索及蛋白质变体的鉴定结果。基于从UniProt网站下载的人类核心组蛋白H4的纯文本文件和“鸟枪法”注释,ProteinGoggle 2.0首先创建包含所有可能蛋白质变体的理论数据库;从纯文本文件中提取的信息主要是氨基酸序列、可能的翻译后修饰（单甲基化、二甲基化、三甲基化、乙酰化和磷酸化）及氨基酸变异（A77→P）。在控制质谱水平假阳性率低于1%的前提下,共鉴定到426个蛋白质变体,这是目前为止H4蛋白质变体的最全报道。这些ProteinGoggle 2.0鉴定到的H4蛋白质变体也与之前报道的ProSightPC 2.0的鉴定结果进行了肩并肩比较。总而言之,ProteinGoggle 2.0可以对具有复杂组合修饰及氨基酸变异的蛋白质组进行数据库搜索和蛋白质变体鉴定。     

奇异变形杆菌中赖氨酸-2-羟基异丁酰化蛋白的分析

蛋白质的赖氨酸修饰广泛参与基因调控、转录、代谢等重要的生物过程。在真核细胞组蛋白上发现了一种新的赖氨酸修饰--2-羟基异丁酰化,这种修饰对于生殖细胞分化具有调控功能。该研究旨在探索这种修饰在原核生物非组蛋白中的特征。通过亲和富集、高效液相色谱-串联质谱鉴定和生物信息学分析,在奇异变形杆菌中鉴定到大量未见报道的2-羟基异丁酰化蛋白及其位点,进而考察了原核生物中2-羟基异丁酰化修饰蛋白的分布特征、分子网络和通路特点。研究表明,赖氨酸-2-羟基异丁酰化在原核生物中具有广泛的分布,其生物学意义值得进一步研究。     

科学家研制出速测组蛋白甲基化试纸条

<正>中科院广州生物医药与健康研究院曾令文研究组,研制出一种快速灵敏检测组蛋白甲基化的试纸条。相关成果发表在《分析化学》。据介绍,组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,通常发生在氨基末端的赖氨酸或者精氨酸上,同其他调节蛋白和DNA相互作用,参与基因的调节和染色质高级结构的形成。细胞染色质中不同类型的组蛋白甲基化具有不同的意义,这往往取决于组蛋白被甲基化的位置和甲基化的程度。常用的     

石蜡包埋组织中组蛋白的提取分离和翻译后修饰的定量分析

组蛋白翻译后修饰(HPTMs)参与基因转录调控,其异常与肿瘤等重大疾病的发生发展密切相关。石蜡包埋组织是当前疾病研究的重要样本资源,对肿瘤机制和标志物研究具有重要意义。目前基于质谱的蛋白质组学技术已成为HPTMs分析的有力工具,而针对福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品的HPTMs分析还十分有限。该研究发展了一种基于高效液相色谱-串联质谱的FFPE组织样本HPTMs分离分析新方法。通过研究并优化组蛋白的提取策略,建立了FFPE组织样本脱蜡水化处理、蛋白质提取与聚丙烯酰胺凝胶电泳分离相结合的组蛋白提取和分离方法。通过研究FFPE切片数量、组蛋白化学衍生化方法等对组蛋白鉴定的影响,确定了组蛋白处理的具体步骤。通过HPLC分离结合非依赖性采集模式的质谱分析,鉴定了组蛋白修饰的类型、位点和丰度。最后,将优化的实验方法应用于FFPE临床样本的HPTMs分析,鉴定了2例人乳腺浸润性癌和癌旁正常组织的HPTMs图谱,均获得了100种以上的不同组蛋白修饰形式的多肽。定量分析了他们的差异性水平,通过主成分降维分析,发现浸润性癌和癌旁正常组织之间组蛋白修饰丰度存在明显的差异,且差异性具有一定的规律,特别是涉及转录调控的组蛋白修饰与乳腺癌的预后和治疗靶点具有相关性,进而探讨了乳腺癌中异常HPTMs的生物学意义。该研究对临床石蜡样本中组蛋白修饰的分离分析以及肿瘤表观遗传标志物的检测进行了有益的探索。     

基于生物质谱技术的磷酰化修饰策略在多肽测序中的应用

该文建立了一种利用磷酰化修饰结合电喷雾质谱(ESI-Q-TOF)测定多肽氨基酸序列的有效方法。利用Atherton-Todd反应,以二丙基亚磷酰酯(DPP)为磷酰化试剂,应用生物质谱技术,对磷酰化修饰后的5种模型肽的磷酰化反应情况进行了系统研究,考察了磷酰化肽的二级质谱特征,并与未经磷酰化反应的肽的二级质谱特征对比。结果表明,经过磷酰化修饰后,肽的二级质谱中的a1离子信号强度明显增加,可以准确鉴定其N端氨基酸;b系列离子信息完整,信号强度增强,使得多肽C ID测序的谱图简单、清晰,有利于肽的氨基酸序列的测定;赖氨酸(K,128.10 u)和谷氨酰胺(Q,128.13 u)两种氨基酸质荷比相近,由于二者磷酰化修饰后的差异性,使其得到准确区分。经过5种已知氨基酸序列的模型肽的磷酰化后结合质谱技术进行氨基酸序列测定验证,结果表明该方法简单、快速、准确,提高了利用质谱技术进行多肽测序的准确度和灵敏度,可为蛋白质组学研究提供有效的技术手段。     

谷氨酸甲基化修饰的基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱分析

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了枯草芽孢杆菌中的蛋白酶抑制剂和杆菌肽F两种蛋白及其翻译后修饰,发现在这两种蛋白质中共有5个肽段发生谷氨酸甲基化,其中肽段FELVVYDSEHK存在FE(Methylation)LVVYDSEHK和FELVVYDSE(Methylation)HK两种形式。结果表明,MALDI-TOF/TOF高能CID所提供的丰富断裂信息和全质量范围扫描对提高分析结果的确定性具有重要作用。此外,这5个甲基化肽段都可以检测到相对含量更高的非甲基化肽段,这为降低分析结果的假阳性提供了辅助判据。在低质量区检测到甲基化赖氨酸的亚胺相关离子m/z 98和143,说明发生了赖氨酸的甲基化;检测到m/z 116则提示发生了谷氨酸甲基化。     

乙酰化蛋白的质谱鉴定研究

报道了两种生物质谱技术ESI-MS和MALDI-MS在鉴定乙酰化修饰蛋白BSA-ac中的应用研究结果. 乙酰化修饰蛋白通过特征碎裂峰m/z 126.1或MS/MS质谱图中相差一个赖氨酸的相邻b或y离子之间170 Da分子量的差异确证赖氨酸乙酰化修饰, 并且后者提供具体修饰位点信息. 研究提示ESI-MS和MALDI-MS两种质谱技术均可用于鉴定实际复杂样品中的乙酰化蛋白, 且在乙酰化蛋白的鉴定中各有其优点.     

蛋白质甲基化修饰的蛋白质组学分析方法新进展

蛋白质的甲基化修饰是一类重要的翻译后修饰。但与磷酸化、糖基化和泛素化等翻译后修饰相比,甲基化修饰的蛋白质组学分析方法开发还是一个较新的研究领域。近几年,由于甲基化修饰在表观遗传调控中的重要作用,这一修饰类型得到了越来越多的关注,相关的分析技术和分析方法也取得了较多进展。其中,基于质谱的蛋白质组学分析方法在甲基化修饰中发挥着关键的作用,实现了这一甲基化修饰的高通量分析。该综述将从甲基化修饰的分离富集、假阳性率控制以及定量蛋白质组学等方面对一些蛋白质甲基化修饰的分析技术和方法的最新进展进行介绍。     

The Distribution of Total Particulate Matter (TPM) And Nicotine Between Mainstream and Sidestream Smoke in Bidis and Cigarettes

ABSTRACT

The mainstream (MS) and sidestream (SS) smoke of three types of popular Indian cigarettes, a brand of low tar Indian cigarettes, a brand of US cigarettes and two brands of popular Indian bidis were analysed for carcinogenic total particulate matter (TPM) and nicotine levels employing standard smoking conditions and/or modified smoking standards.

The analysis clearly demonstrated relatively higher levels of TPM and nicotine in MS of three types of popular Indian cigarettes when compared with a brand of low tar Indian cigarettes or a brand of US cigarettes or reported values for MS of western cigarettes. This was also reflected in MS/SS ratios of TPM and nicotine as TPM and nicotine levels in SS of Indian and US cigarettes were similar, when tested employing standard smoking conditions.

Comparative analysis of Indian bidis/cigarettes and a brand of US cigarettes employing modified smoking standard (i.e. 2 puffs/min instead of 1 puff/min) revealed significantly lower values of TPM and nicotine in SS of Indian bidis when compared with corresponding values in Indian/US cigarettes. This shows that contribution of TPM and nicotine in SS from a single bidi to environmental tobacco smoke (ETS) is very much less than that of a single cigarette, and contribution of SS from Indian and US cigarettes to ETS appear to be similar. Reduced levels of TPM and nicotine in SS of bidis, probably due to lack of added burning agents, result into relatively higher deliveries of TPM and nicotine in MS as reflected by higher MS/SS values.     

三维有序金掺杂纳米TiO_2修饰电极用于抗肿瘤药物与DNA相互作用的研究

利用模板法在氧化铟锡(ITO)电极表面制备了三维有序多孔结构的金掺杂纳米Ti O2薄膜修饰电极(3DOM GTD/ITO),并在此修饰电极上成功固定小牛胸腺DNA(ct DNA),从而构建了一种新型的DNA生物传感器(DNA/3DOM GTD/ITO),并通过透射电镜(TEM)、扫描电镜(SEM)对修饰电极的表面形貌进行表征。采用电化学交流阻抗(EIS)法研究了ct DNA在3DOM GTD/ITO修饰电极表面的固定情况,结果表明,ct DNA已被成功地固定在3DOM GTD/ITO修饰电极表面。采用循环伏安法、微分脉冲伏安法等电化学方法研究了抗肿瘤药物槲皮素(Qu)在3DOM GTD/ITO修饰电极表面的电化学性质及与ct DNA的相互作用。结果表明,Qu在3DOM GTD/ITO修饰电极表面有1对准可逆的氧化还原峰,其氧化还原反应为2电子和2质子的转移过程。Qu可与固定在修饰电极上的ct DNA发生较强的结合作用,其结合常数(K)为3.61×106L/mol。循环伏安实验、紫外-可见吸收光谱、分子荧光光谱、圆二色性光谱均表明Qu与ct DNA之间的相互作用模式为嵌插作用。Qu与ct DNA的碱基结合具有序列选择性,对Qu与聚(d G-d C)及聚(d A-d T)的结合常数进行计算,得到结合常数比K(d G-d C)/K(d A-d T)=3.5,表明Qu与ct DNA发生嵌插作用时更倾向于结合在GC富集区域。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定调制乳中3种磺胺类药物残留

建立了一种超高效液相色谱-串联质谱测定调制乳中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶残留的方法。调制乳经1%(v/v)乙酸水溶液和甲醇提取、沉淀蛋白质,HLB固相萃柱萃取净化处理后上机检测。采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱,以0.1%(v/v)甲酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱,使用电喷雾离子源,在正离子模式下进行数据采集。采用基质标准样品添加法绘制标准曲线,外标法定量,方法的定量限为1 μg/kg。在1~100 μg/L范围内3种磺胺类药物标准曲线的线性关系良好(相关系数(R²)≥0.998);在1、2和10 μg/kg 3个加标水平下,方法的回收率为76.5%~101.9%,相对标准偏差为1.2%~12.4%。该方法简便、快速、实用、准确,各项技术指标满足国内外法规的要求,可用于调制乳中磺胺类药物残留的确证检测。     

Tandem mass spectrometric sequence characterization of synthetic thymidine-rich oligonucleotides

Tandem mass spectrometry (MS/MS) can provide direct and accurate sequence characterization of synthetic oligonucleotide drugs, including modified oligonucleotides. Multiple factors can affect oligonucleotide MS/MS sequencing, including the intrinsic properties of oligonucleotides (i.e., nucleotide composition and structural modifications) and instrument parameters associated with the ion activation for fragmentation. In this study, MS/MS sequencing of a thymidine (T)-rich and phosphorothioate (PS)-modified DNA oligonucleotide was investigated using two fragmentation techniques: trap-type collision-induced dissociation (“CID”) and beam-type CID also termed as higher-energy collisional dissociation (“HCD”), preceded by a hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) separation. A low to moderate charge state (−4), which predominated under the optimized HILIC-MS conditions, was selected as the precursor ion for MS/MS analysis. Comparison of the two distinctive ion activation mechanisms on the same precursor demonstrated that HCD was superior to CID in promoting higher sequence coverage and analytical sensitivity in sequence elucidation of T-rich DNA oligonucleotides. Specifically, HCD provided more sequence-defining fragments with higher fragment intensities than CID. Furthermore, the direct comparison between unmodified and PS-modified DNA oligonucleotides demonstrated a loss of MS/MS fragmentation efficiency by PS modification in both CID and HCD approaches, and a resultant reduction in sequence coverage. The deficiency in PS DNA sequence coverage observed with single collision energy HCD, however, was partially recovered by applying HCD with multiple collision energies. Collectively, this work demonstrated that HCD is advantageous to MS/MS sequencing of T-rich PS-modified DNA oligonucleotides.     

AAPBA@KCC-1的合成及其对血清中唾液酸和神经节苷脂的分析应用

将3-丙烯酰胺基苯硼酸(AAPBA)修饰在介孔二氧化硅KCC-1的表面,合成AAPBA@KCC-1材料,并通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、N_2吸附解吸附测试和X射线光电子能谱对其进行表征;将AAPBA@KCC-1材料作为分散固相萃取(dSPE)的吸附剂,对血清样品中的唾液酸和神经节苷脂(GLS)进行提取和富集;采用傅里叶变换离子回旋共振质谱法和超高效液相色谱-离子淌度-四极杆飞行时间质谱法分别对AAPBA@KCC-1材料吸附得到的唾液酸和神经节苷脂进行分析。结果表明,AAPBA@KCC-1材料能够有效吸附唾液酸和神经节苷脂,简化了样品前处理的操作,可以进一步应用于生物样品中唾液酸和神经节苷脂的研究。     

改良QuEChERS结合超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速检测茶叶中95种除草剂残留

基于改良的QuEChERS方法,建立了超高效液相色谱-高分辨质谱同时测定茶叶中95种常见除草剂残留量的定性定量方法。实验以回收率和色素清除效率为指标,通过评估多壁碳纳米管（MWCNTs）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）和甲苯等在前处理步骤中的影响,优化了经典QuEChERS方法,最终采用含1%（v/v）乙酸的乙腈-甲苯（9：1,v/v）溶液提取,结合12.5 mg GCB、12.5 mg MWCNTs和150 mg PSA混合吸附剂净化的前处理方法。采用Hypersil Gold C18色谱柱分离,在全扫描和自动触发二级质谱（Full MS/dd-MS²）模式下,用四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测,基质匹配校准曲线定量。结果表明,茶叶中95种除草剂在3个加标水平下的回收率为63.3%~129.1%,相对标准偏差（RSD）为0.7%~15.2%。该法简便、灵敏、快速、假阳性率低,适用于茶叶等复杂植物基质样品中多种除草剂的定性定量分析。     

Specific tandem mass spectrometric detection of AGE‐modified arginine residues in peptides

Glycation is a non‐enzymatic reaction of protein amino and guanidino groups with reducing sugars or dicarbonyl products of their oxidative degradation. Modification of arginine residues by dicarbonyls such as glyoxal and methylglyoxal results in formation of advanced glycation end‐products (AGEs). In mammals, these modifications impact in diabetes mellitus, uremia, atherosclerosis and ageing. However, due to the low abundance of individual AGE‐peptides in enzymatic digests, these species cannot be efficiently detected by LC‐ESI‐MS‐based data‐dependent acquisition (DDA) experiments. Here we report an analytical workflow that overcomes this limitation. We describe fragmentation patterns of synthetic AGE‐peptides and assignment of modification‐specific signals required for unambiguous structure retrieval. Most intense signals were those corresponding to unique fragment ions with m/z 152.1 and 166.1, observed in the tandem mass spectra of peptides, containing glyoxal‐ and methylglyoxal‐derived hydroimidazolone AGEs, respectively. To detect such peptides, specific and sensitive precursor ion scanning methods were established for these signals. Further, these precursor ion scans were incorporated in conventional bottom‐up proteomic approach based on data‐dependent acquisition (DDA) LC‐MS/MS experiments. The method was successfully applied for the analysis of human serum albumin (HSA) and human plasma protein tryptic digest with subsequent structure confirmation by targeted LC‐MS/MS (DDA). Altogether 44 hydroimidazolone‐ and dihydroxyimidazolidine‐derived peptides representing 42 AGE‐modified proteins were identified in plasma digests obtained from type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients. Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定乳胶儿童用品中15种N-亚硝胺及其前体物的迁移量

建立了同时测定乳胶儿童用品中15种N-亚硝胺及其前体物迁移量的固相萃取-气相色谱-串联质谱(SPEGC-MS/MS)分析方法。以人工唾液作为迁移模拟物,以Chromabond Easy固相萃取柱(填料的主要成分是极性修饰的聚乙烯-二乙烯基苯共聚物)对迁移液中的N-亚硝胺分析物进行净化,采用HP-5 MS UI色谱柱分离,MS/MS在多反应监测模式下进行定性及定量分析。15种N-亚硝胺在5~2 000μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数均大于0.998;方法定量限(S/N=10)为0.625~12.50μg/kg,低于欧盟2 009/48/EC指令的限量要求。在低、中、高3个添加水平的回收率为53.8%~116.2%、52.7%~105.1%和49.5%~102.9%;日内精密度分别为1.3%~14.0%(n=6),日间精密度为1.6%~7.6%(n=4)。采用本方法对婴儿奶嘴样品和气球样品进行了测定,其中4件奶嘴和7件气球样品中检出亚硝胺及其前体物,奶嘴和气球中N-亚硝胺的总检出含量分别为0.049 9~0.126mg/kg和0.515~41.2 mg/kg;N-亚硝胺前体物总检出量分别为0.026 4~0.030 0 mg/kg和0.187~12.5mg/kg。     

Discrimination of Thermoplastic Polyesters by MALDI-TOF MS and Py-GC/MS

The aim of this work is to discriminate thermoplastic polyester-polyethylene terephthalate (PET), polybutylene terephthalate (PBT), and polytrimethylene terephthalate (PTT), which cannot be easily identified by many methods. Both matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and pyrolysis gas chromatography/mass spectrometry (Py-GC/MS) were applied to identify these polyesters owing to their analytical ability to determining polymers' chemical structure. The three thermoplastic polyesters can be easily distinguished by MALDI-TOF MS according to their different repeated units. Py-GC/MS was used to analyze their specific pyrolyzates. The three polyesters can be identified through their characteristic pyrolysis products as well.     

Depolymerization of Poly（bisphenol A carbonate） in Subcritical and Supercritical Toluene

The depolymerization of poly(bisphenol A carbonate)(PC) in subcritical and supercritical toluene was studied. The experimental parameters, which influence the depolymerization reaction such as temperature (570-633 K), pressure (4.0-7.0 MPa), reaction time (5-60 min), and toluene to PC weight ratio (3.0-11.0), were investigated, and the reaction products were determined by GC, GC/MS and FT-IR spectrometer. It was found that the main product of the depolymerization reaction was bisphenol A(BPA). BPA accounted for over 55.7% of the depolymerization products at reaction temperature 613 K, pressure 5.0-6.0 MPa, reaction time 15 min and toluene/PC weight ratio of around 7.0.