抗幽门螺杆菌尿素酶B纳米抗体的制备及鉴定

制备抗幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）尿素酶B（UreB）纳米抗体。用灭活的全幽门螺杆菌免疫羊驼,以重组蛋白UreB为靶分子,从噬菌体展示文库中筛选出能与重组蛋白UreB特异性结合的纳米抗体,构建原核表达载体,IPTG诱导表达,ELISA鉴定纳米抗体特异性。获得5×107cfu的噬菌体文库,将筛选的两个OD450值较高且序列不同的纳米抗体HU2-9和HU2-36分别进行表达SDS-PAGE鉴定均为可溶性且表达量分别为92和32 mg·L-1。ELISA结果表明两个纳米抗体能特异性结合Hp菌体蛋白,并对尿素酶活性具有一定的抑制作用。成功淘选出6种独特序列的抗幽门螺杆菌UreB纳米抗体。     

抗杀鲑气单胞菌抗原的单克隆抗体的制备及初步应用

杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）是鲑类疑难细菌性肾脏病原菌之一。用该菌免疫BALB/c鼠,取其脾细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合。酶联免疫吸附分析法（ELISA）及萤光抗体法（FAT）筛选所需单克隆抗体。有限稀释法克隆化建立了一株抗杀鲑气单胞菌抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株     

NFLX抗原模拟表位的淘选及鉴定

从噬菌体随机肽库中淘选模拟NFLX(Norfloxacin)表位的噬菌体粒子并进行性质鉴定。以抗NFLX单克隆抗体为靶分子,对噬菌体环七肽库和十二肽库进行生物亲和淘选,以ELISA鉴定阳性克隆,进行DNA测序,采用生物信息学方法对淘选得到的模拟表位进行分析。分别得到了9个(环七肽)和8个(十二肽)能与靶分子特异性结合且能被NFLX标准品阻断的阳性克隆,其特有序列为(环七肽):X-X-X-X-X-脯氨酸-苯丙氨酸(X为任意氨基酸),以阻断效果最好的抗原模拟表位H3建立了竞争ELISA标准曲线,IC 50为:(48.07±6)ng·mL-1,检测线性范围为10~200ng·mL-1。噬菌体展示技术可淘选得到NFLX模拟表位,淘选到的噬菌体粒子可作为NFLX的替代品建立免疫学检测方法。     

蛋白A-藻蓝蛋白β亚基融合蛋白的性质及应用

PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A基因spa,通过酶切位点的转换构建重组质粒pET-spa,进一步成功构建能表达融合蛋白SPA-CpcB的质粒pET-spa-cpcB.将重组质粒pET-spa-cpcB与在大肠杆菌内生成藻胆色素必需的质粒,以及藻胆蛋白裂合酶质粒,共同转入大肠杆菌BL21(DE3)内,进行体内重组,生物合成融合色素蛋白.蛋白质电泳以及锌染色结果表明,体内重组分别获得了融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB.吸收光谱与荧光光谱结果表明,融合色素蛋白SPA-CpcB-PCB或SPA-CpcB-PEB具有与CpcB-PCB或CpcB-PEB相同的光谱特征.将SPA-CpcB-PEB与生物素标记的兔抗体进行荧光免疫反应,通过多功能微孔板荧光检测仪检测,结果表明融合色素蛋白SPA-CpcB-PEB具有SPA能与多种哺乳动物血清中的IgG的Fc段结合的特点.利用SPA-CpcB-PEB来检测包被于聚苯乙烯微量反应板的基因编码为all5292的蛋白,证实了该融合色素蛋白可用于免疫检测.     

SARS-CoV S蛋白的原核表达及其粘膜免疫效应

SARS冠状病毒（SARS-CoV）的S（Spike）蛋白是病毒表面最主要的膜蛋白，在病毒的感染过程中起重要作用，是冠状病毒的主要抗原．以SARS冠状病毒的cDNA为模板，通过PCR得到S△1（151～1200bp）、S△2（1201～2250bp）和S△3（2251～3150bp）3段基因序列，克隆到表达载体pET-32a，在大肠杆菌BL21中诱导表达得到包涵体蛋白，经Western blot检测正确后，将此作为抗原以滴鼻和腹腔注射两种小同的途径免疫BALB／c雌性小鼠，3次免疫之后采集小鼠的血清和肺洗液，经酶联免疫吸附实验（enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA）检测其中的抗体IgG和IgA．结果表明S蛋白通过滴鼻途径既能刺激产生一定的血清IgG，更能诱导肺粘膜产生特异IgA抗体．进一步比较分析发现，诱导粘膜免疫的效应区域主要位于S△2（401～750aa）蛋白区段．     

高亲和力抗eGFP纳米抗体的筛选与应用

将增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP）免疫羊驼后构建纳米抗体免疫库,固相淘选eGFP纳米抗体;构建E.coli Rosetta表达载体,诱导表达纳米抗体,并鉴定其结合活性及特异性;辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）标纳米抗体,确定其工作浓度及稳定性;将纳米抗体与纳米磁珠偶联应用于免疫沉淀B13-EGFP融合蛋白。四免后抗血清滴度超过1.28×106,获得库容量为1.85×108 cfu的抗eGFP纳米抗体噬菌体展示文库;原核表达10种独特基因序列的纳米抗体,均为可溶性表达;采用ForteBio Octet确定出纳米抗体4-28与eGFP的亲和常数（KD）最高,达到9.67×10-11M;纳米抗体4-28与eGFP、绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）特异性结合;HRP标记纳米抗体4-28检测范围是1:10 000～1:25 000(浓度100～40 ng·mL-1),比市场上现有的检测二抗（稀释范围1:5 000～1:20 000）灵敏度更高;纳米抗体4-28偶联羧基化纳米磁珠,免疫沉淀B13-eGFP融合蛋白,实现了简单快速分离目的蛋白B13-eGFP。     

转基因蛋白Cry1AC的非标记阻抗型电化学免疫传感器的构建

Cry1Ac蛋白作为一种重要的生物杀虫剂,在转基因作物中应用广泛,对转基因作物及其产品中Cry1Ac蛋白的含量进行监测,是保障食品安全及消费者知情权的重要手段。本研究在获得抗Cry1Ac蛋白单克隆抗体的基础上,以其为核心识别元件,构建非标记阻抗型电化学免疫传感器,结果显示,本研究建立的Cry1Ac阻抗性电化学免疫传感器的线性范围为0.98~125ng·mL-1,最低检测限为0.80ng·mL-1,样品加标回收率为80%~110%,并与其它蛋白无交叉反应,为转基因作物及其产品中Cry1Ac蛋白的快速检测提供了一种新的方法。     

HEV嵌合抗原的克隆表达及在抗-HEV ELISA试剂中的应用

通过反转录从戊肝病人粪便中克隆了戊型肝炎病毒（HEV）第二（ORF2）和第三（ORF3）读码框区的抗原决定簇基因，利用基因工程手段，在大肠杆菌中表达了含有上述二种抗原的融合蛋白，该融合蛋白具有良好的抗原性和特异性，以该融合蛋白为抗原制备的抗－HEV ELISA试剂检测中国药品生物制品检定所40份标准血清时，其阴性、阳性符合率分别达29／30、10／10，符合国家标准。     

环加氧酶2基因的原核表达、抗体制备及其在肝癌中的表达

用PCR技术扩增环加氧酶2（COX-2）基因的C末端777bp的片段，插入到pET-28b（＋）中，构建原核表达载体．转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导产生包涵体形式his-COX-2融合蛋白．用镍离子螫合柱（Ni—NTA）纯化融合蛋白，获得纯度较高的原核表达蛋白．纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，用ELISA及Western blotting分别检测抗体．用此抗体Western blotting检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．ELISA及Western blotting结果显示免疫家兔所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价，并能够特异性的识别真核细胞中的环加氧酶2．用此抗体检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．证实肝癌组织中伴随有环加氧酶2的大量表达．同时所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价和特异性，为进一步研究环加氧酶2的功能提供了条件。     

载体表达siRNA抑制HBV复制与基因表达

用载体表达siRNA的方法并通过RNA干扰达到抑制乙型肝炎病毒（HBV）的复制及其基因的表达．针对HBV的S基因选取4个靶位点，并将目的基因与荧光素酶报道基因构成快速筛选系统，从4个位点中筛选到一个有效的作用位点．用半定量RT-PCR、ELISA、Western blot和荧光定量PCR等方法对筛选到的有效位点进行了验证，结果表明，siRNA成功降解了HBVS基因的mRNA，降低了S蛋白的表达水平，有效地抑制了HBV的复制．     

藻红蓝α亚基脱辅基蛋白基因的克隆和表达

用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从层理鞭枝藻总 Ｄ Ｎ Ａ 中扩增藻红蓝蛋白 α亚基脱辅基蛋白的基因（ｐｅｃ Ａ）, 将ｐｅｃ Ａ 克隆于ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ,然后将ｐｅｃ Ａ 基因插入表达载体ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｄ,形成的重组质粒在 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）中获得了高效表达,表达蛋白形成包涵体．高效表达的蛋白质的分子量为１９×１０３ ,与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的分子量一致,经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 进一步证实该表达蛋白为藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶的表达及抗体制备

以禽流感病毒A／chicken／Hubei／489／2004（H5N1）NA基因全长eDNA克隆pMD-NA为模板，PCR扩增第406位至第1353位基因片段。克隆到pET-28a表达载体，构建重组质粒pET-28／ANA，转化大肠杆菌，用异丙基口硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE和Western blot分析证实，截短的NA重组蛋白获得高效表达。采用SDS-PAGE纯化重组蛋白，免疫家兔，制备特异性神经氨酸酶（NA）抗体。ELISA及间接免疫荧光检测结果显示，该抗体效价在1：1×10^5以上，能与在大肠杆菌和Vero细胞中表达的NA蛋白产生特异性反应。纯化的NA重组蛋白可用作建立禽流感检测方法的诊断抗原，所制备NA抗体可用于检测禽流感基因工程疫苗中的NA抗原组分。     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

大豆种子形态建成期与成熟期正反抑制消减文库构建及差异表达基因分析

为了分析大豆种子形态建成期与成熟期基因差异表达情况,获得在发育过程中可能影响大豆种子形态建成及蛋白质、油脂合成代谢等调控的重要基因,利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了高含油量大豆品种中豆32开花后15天胚和36天胚正反消减文库.从正反消减文库中挑取克隆,经PCR及点杂交筛选后,从15天胚消减库(正向)和36天胚消减库(反向)中分别挑选了476个和471个有效克隆测序, 经BLAST比对归并后,根据测序结果设计基因特异引物,通过半定量PCR和荧光定量PCR检测了13个差异表达基因,其中正向库5个,反向库8个.对这些差异表达基因的组织特异性检测表明,仅发现4-662(蔗糖结合蛋白基因)在胚中特异表达.对这些基因在大豆种子发育过程中的作用进行了讨论.     

硼酸化量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测甲胎蛋白

提高表面抗体活性是免疫检测探针制备的关键。硼酸可与IgG的糖基化Fc片段快速发生位点特异性结合,充分暴露抗原结合区Fab片段以提高抗体活性,避免常用的酰胺键共价偶联方法引起的抗体取向不当及自交联。本研究在合成硼酸修饰的聚马来酸酐-alt-1-十八碳烯（PBA-PMAO）的基础上,采用超声乳化法制备表面硼酸改性的量子点荧光微球（PBA-QBs）。该微球既可与抗体简便、快速地定向偶联,又因量子点含量高而具有很强的荧光信号。将其与甲胎蛋白（AFP）单克隆抗体室温共孵育5 min制备高抗体活性的荧光免疫层析检测探针并用于定量检测AFP,线性范围为0.98～31.25 ng mL-1,最低检测限为0.45 ng mL-1,检测耗时20 min。血清样品中AFP的加标回收率为91.0%～107.1%,批内、批间变异系数介于3.65%～10.42%。     

一个新的调控人类细胞死亡基因的发现

ａｓｙ基因是最近发现的一个凋亡诱发基因［１］,但诱发细胞凋亡的机制仍不清楚为研究ａｓｙ基因诱发凋亡的机制,本文以ＡＳＹ为诱饵蛋白（Ｂａｉｔ）,采用酵母双杂交系统从人肺细胞系（ＷＩ３８）ｃＤＮＡ文库中筛选ＡＳＹ结合蛋白基因从１×１０６个共转化子中,分离鉴定了３个Ｈｉｓ＋ＬａｃＺ＋克隆,其中一个克隆的插入片段与Ｇｅｎｂａｎｋ全序列比较没有发现同源基因,推测为一个新基因,命名为ａｓｙ相互作用蛋白基因ａｓｙｉｐ（ａｓｙｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）ａｓｙｉｐ基因在人的各种组织中均组成性转…     

特香型白酒大曲中酵母菌的筛选及产香性能

采用传统纯培养方法从秋季特香型白酒大曲中分离出40株酵母菌,对其菌落形态、细胞形态、子囊孢子进行观察分类,并结合26S rRNA分子学鉴定筛选出8株酵母菌,分别命名为阿萨丝孢酵母（Trichosporon asahii）NCUF 301.1、库德里阿兹威毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）NCUF 302.1、酿酒酵母（Saccharomyces cersvisiae）NCUF 303.1、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）NCUF 304.1、戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）NCUF 305.1、光滑假丝酵母（Candida glabrata）NCUF 306.1、粉状毕赤酵母（Millerozyma farinose）NCUF 307.1及异常毕赤酵母（Pichia anomala）NCUF 308.1。对这8株酵母菌发酵力、酯化力和挥发性代谢产物进行系统分析后发现S.cersvisiae NCUF 303.1发酵力(5.22 U·g-1)显著高于其它酵母菌,W.anomalus NCUF 304.1酯化力(60.00 U·g-1)和挥发性代谢产物含量(7.73 mg·kg-1)最高。本研究结果可为筛选具有高发酵性能的酿酒酵母及产香酵母用于实际酿酒生产提供理论依据。     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.     

基于Kaya扩展的浙江能耗氮排放及其影响因素研究

将1980~2014年浙江省天然能耗氮排放过程分为3个阶段：1980~1990,1991~2000,2001~2014,采用Kaya扩展恒等式并结合LMDIM,研究了1980~2014年浙江省天然能耗氮排放的主要推动因子.并通过分析1980年以来浙江省社会经济发展趋势和排氮量变化特征,定量分析了经济产出、人口规模、能源强度、能源结构和能源替代效应分别在3个阶段的贡献.得到：（1）氮排放增长的首要正影响因子为经济产出,其次为人口规模.（2）改革开放以来,能耗强度的降低抑制了氮排放,能源强度为负效应.（3）能源结构效应和能源替代效应也为负效应,但在第3阶段,二者均由负效应转变为正效应.     

人丙型肝炎病毒核心抗原基因的表达和纯化

人丙型肝炎病毒Ｉ型（ＨＣＶ－Ｉ）核心抗原编码区ｃＤＮＡ，全长５７３ｂｐ，编码１９１个氨基酸，被克隆到一种新的表达质粒ｐＲＳＥＴＨｉｓＢ中，转化大肠菌ＢＬ２１菌株，在１ｍｍｏｌＬ－１ＩＰＴＧ诱导３７℃培养５ｈ，核心抗原表达水平达到高峰，表达出分子量２６×１０３的融合蛋白，并在细胞内形成微小晶体．表达水平达到细胞总蛋白的４０％左右，通过纯化，获得的核心抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检查为均一分子量２６×１０３的蛋白，用酶联免疫法进行血清学初步检查，纯化的核心抗原与ＨＣＶ阳性血清显示出强烈的阳性反应，对慢性丙肝病人血清中抗ＨＣＶ抗体的阳性检出率达９３％，而与正常人血清则无阳性反应