体外分阶段共培养法扩增的脐血造血干/祖细胞移植于NOD/SCID小鼠的实验研究

研究用分阶段共培养法进行体外扩增的脐血造血干/祖细胞对NOD/SCID小鼠重建造血功能的作用,探讨新扩增技术体系对将来临床移植的可行性.分离脐血单个核细胞,分别用rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF组合(非共培养组合)和rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF+人骨髓间充质干细胞组合(共培养组合)进行脐血造血干/祖细胞的体外扩增,并对扩增细胞进行流式细胞术和细胞集落形成能力分析.在移植实验中,将经致死剂量射线照射后的NOD/SCID小鼠随机分为3组,每组10只.A组:每只移植8.5×106个用rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF+人骨髓间充质干细胞组合扩增的细胞;B组:每只移植8.5×106个用rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF组合扩增的细胞;C组:每只仅输注0.5 mL生理盐水.移植后定期眼眶底部采血,分析重建造血.12周后取存活小鼠骨髓,检测人特异Alu基因的存在率.实验结果表明,rhSCF+rhG-CSF+rhMDGF+人骨髓间充质干细胞组合的共培养法显著提高了造血干/祖细胞的扩增倍数,并且有利于造血干/祖细胞的自我更新和提高细胞集落形成能力.两种组合扩增的细胞移植小鼠12 d后,小鼠的白细胞类群开始回升,25 d后基本恢复到了基数水平.在45～55 d后小鼠细胞有明显的第2个恢复期,并且共培养组合扩增细胞移植的小鼠中第2次恢复明显快于非共培养组合.12周后在两种组合移植的小鼠中检测到人特异Alu序列片段的概率分别为87.5%(7/8)和88.9%(8/9).由此可推论,分阶段共培养扩增体系有效地提高了脐血造血干/祖细胞的扩增能力和重建造血能力.     

骨髓间充质干细胞与造血干细胞共培养对脐血造血干细胞扩增的作用

脐带血造血干细胞的异体移植对高剂量化疗的患者恢复造血功能是一种有效的细胞学疗法，脐带血造血干细胞的体外扩增能提高有效植入的造血干／祖细胞的数量，将扩增10d造血干／祖细胞移植给高剂量化疗的成人患者，患者平均约在移植后的第26天（第15－45天）达到了嗜中性粒细胞的植入，为了加快有核细胞数量的扩增和嗜中性粒细胞的成熟，在以骨髓间充质干细胞的培养基质细胞层，采取阶段扩增方法培养单个核细胞和分选的CD34^ 细胞，并与无骨髓间充质干细胞的培养体系进行对照，从冻存的脐带血中分离的单个核细胞和CD34^＋细胞分别在含有骨髓间充质干细胞的100mL培养袋中用50mL ADM培养液培养7d,7d后收获细胞并移入含有1L ADM培养液的1L培养袋中继续培养7d，每天计数细胞量，14d后收获细胞，并进行相应的细胞分析，扩增的结果表明，在有骨髓间充质干细胞的共培养体系中，单个核细胞培养的有机细胞扩增了346倍，CD34^ 细胞培养的有核细胞扩增了674倍，无骨髓间充质干细胞的非共培养体系中，两者分别扩增了152倍和377倍，两种培养体系都获得了定向祖细胞（GM－CFC）和原始祖细胞（HPP－CFC）的扩增，有骨髓间充质干细胞的共培养体系获得了更多的嗜中性粒细胞。     

脐带血造血干/祖细胞体外扩增制剂及其临床前安全性检测分析

造血干细胞移植（HSCT）可用来治疗多种恶性造血系统疾病．HSCT成功植入的先决条件之一是必须输入足够量的造血干／祖细胞（HS／PCs）．细胞剂量过少会导致植入时间延长,移植失败的可能性增大．从脐带血中直接分离的造血干细胞因数量较少而不能满足临床移植的需要．利用骨髓间充质干细胞作为滋养层联合细胞因子组合（SCF＋G-CSF＋TPO）使脐血造血干／祖细胞体外扩增75．2±15．0倍,CD34^＋细胞扩增33．4±12．3倍．将扩增的细胞收集,重新悬浮于L-15培养液中制成造血干／祖细胞制剂,并在建立相应的检测技术基础上,进行了细胞制剂的无菌检测以及细胞制剂中细菌内毒素、牛血清残留量和干细胞因子残留量的检测．通过上述检测分析,为扩增的造血干／祖细胞制剂服务临床需要,辅助治疗恶性血液病和再生障碍性贫血以及遗传性贫血重建造血功能提供实验依据．     

人骨髓间充质干细胞的扩增培养及向成软骨样细胞的定向诱导分化

从人骨髓中分离和培养间充质干细胞(MSCs),在原代和传代培养中其形态学上均为贴壁、纤维状的细胞,随着代次的增加细胞形态更加趋于一致.流式细胞仪鉴定CD45、CD34、CD117、HLA-DR阴性,CD29、CD166阳性,并随着培养代次的增加,阳性比率和阴性比率出现相应的上升和降低,说明细胞中MSCs纯度增加.第三代细胞大约有80%处于G0/G1期,S+G2+M期约20%,说明MSCs有强大的增殖潜能.在传代培养中的最适接种密度为5 000个/cm2左右.MSCs在体外经历了滞缓期、对数生长期、平稳期3个时期,传代培养的MSCs生长速度比原代的MSCs明显快很多.采用程序降温法对MSCs进行冻存,60～90 d后对冻存的MSCs进行复苏,发现MSCs仍可在体外良好生长4～6代,特定的MSCs样本可以扩增10代,说明经过冻存的细胞仍具有良好的增殖能力.对4例标本的前三代MSCs在体外利用TGF-β1和维生素C诱导两周后,用RT-PCR证明MSCs表达软骨特异性的Ⅱ型前胶原的mRNA,说明培养的细胞具有向成软骨样细胞分化的潜能,由此进一步证实其为MSCs.     

人原始生殖细胞的分离和体外培养

从4～10周龄药物流产胚胎的生殖嵴和肠系膜组织中分离原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),培养在添加人重组白血病抑制因子(rh LIF)、人重组碱性成纤维细胞生长因子(rh bFGF)和Forskolin的小鼠饲养层细胞上.经过4～7 d培养,PGCs形成典型的鸟巢状集落.集落在传代过程中保持碱性磷酸酶活性,且胚胎阶段性特异抗原1(SSEA-1)、胚胎阶段性特异抗原3(SSEA-3)免疫荧光染色呈阳性.具有分化潜能的PGCs能在体外连续传代培养12代.结果表明从药物流产胚胎中分离的人类PGCs可以在体外培养成为具有分化潜能的多能性干细胞.     

唑来膦酸/白介素-2诱导的中国恒河猴外周血γδT细胞体外扩增

建立了一种培养及大量扩增中国恒河猴外周血γδT细胞的方法。采用Ficoll密度梯度离心法分离中国恒河猴(rhesus macaque)外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),用含5%猴自体血清、1 000 U·mL~(-1)白介素-2(IL-2)和不同浓度唑来膦酸(1,5,10μmol·L~(-1))的OpTmizer细胞培养基进行培养,并使用流式细胞仪进行纯度及表型分析。结果显示:使用含不同浓度唑来膦酸培养基诱导第8 d时,1μmol·L~(-1)和5μmol·L~(-1)处理组的猴γδT细胞分别扩增至总细胞的91. 4%和93. 1%;5μmol·L~(-1)处理组表达CD56、CD69及HLA-DR蛋白的猴γδT细胞占总细胞的比例分别为75. 6%、75. 5%以及78. 0%;5μmol·L~(-1)处理组表达干扰素IFN-γ的猴γδT细胞比例为84. 8%。本研究通过优化培养基的组成成分,仅添加猴自体血清和IL-2即能有效诱导猴γδT细胞在体外的大量扩增,且培养得到的猴γδT细胞能够显著表达CD56、CD69、HLADR及IFN-γ,并具有较强的免疫激活和细胞杀伤作用。     

免疫球蛋白阳性细胞在大菱鲆免疫相关组织中的分布

采用单克隆抗体免疫组化标记、间接荧光标记法(IFAT)和流式细胞术(FACS),对大菱鲆免疫相关组织中免疫球蛋白(Ig)阳性细胞进行了检测.免疫组化标记后发现,鳃组织中Ig阳性细胞存在于鳃小片上皮细胞与支持细胞之间的间隙中,后肠Ig阳性细胞存在于固有层和粘膜下层中,外周血血涂片中可见Ig阳性细胞,头肾Ig阳性细胞则无规律地散布于肾组织中.间接荧光标记和流式细胞仪分析免疫相关组织中分离的白细胞,发现大菱鲆不同免疫相关组织中Ig阳性细胞的数量不同,Ig阳性细胞数量分别为:鳃(1.60±0.71)%,后肠(3.91±1.06)%,外周血(28.95±0.39)%,头肾(21.54±0.90)%.结果表明,大菱鲆的免疫相关组织(含粘膜组织)具备一定的完成特异性免疫的细胞基础,且不同组织之间的免疫细胞数量存在显著差异.     

高效建立129S1/SvImJ 小鼠胚胎干细胞方法的探讨

选取超排后129S1/SvImJ品系小鼠的优质囊胚,使用辐照后冻存复苏的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,对比高浓度酶短时间消化法和低浓度酶长时间消化法,以0.25%胰酶-0.04%EDTA高浓度酶短时间消化法高效建立了4株小鼠胚胎干细胞系,建系率为36.31%.碱性磷酸酶,核型分析,体外分化和体内分化能力以及小鼠胚胎干细胞表面特异性分子标志0ct-4和Nanog的检测等表明,4个ES细胞系均为典型的小鼠胚胎干细胞系.所建立的ES细胞系为大规模培养ES细胞,进行后续的实验建立了理想的材料平台.     

低温处理增强紫外照射诱导HeLa细胞凋亡

报道了紫外照射诱导体外培养的HeLa细胞凋亡的研究结果,对亚致死低温处理增强紫外照射诱导细胞凋亡的可能性进行了探讨.结果显示HeLa细胞经紫外线照射l0min后培养6h,细胞凋亡指数明显升高,并于照射后30～36h达到高峰(44.82%～70.97%).荧光显微镜下观察可见细胞核固缩、碎裂,DNA凝胶电泳出现特征型的梯状图谱;低温处理后立即照射,可明显增加细胞凋亡指数.但此效应是暂时性的,将4℃处理了12h的细胞恢复于37℃培养24h再行照射,细胞凋亡指数与纯照射组相比并无明显改变(P＞0.05).     

小鼠体外T淋巴细胞集落形成的研究

本文建立了一种改良的适于小鼠脾脏淋巴细胞形成 T 细胞集落的微量甲基纤维素半 固体培养系统.先将脾脏有核细胞含有m l) 的液相中培养 24 小时,然后收集非粘附细胞,将其接种到含甲基纤维和 15 % Co nA一L C M 的半固体系统中培养,细胞的终浓度为.以上培 养 条件是通过正交设计试验所获得的最优组合,可获得高集落形成率.本文还对集落形成细 胞 的性质和集落生长的动力学进行了讨论     

茶叶糖蛋白对树突状细胞表面分子表达的影响

为探讨茶叶糖蛋白对小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)表面分子表达的影响,采用细胞因子诱导法,以贴壁法获得贴壁单核细胞,添加重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素4(rm IL-4)进行体外诱导培养,倒置显微镜动态观察细胞形态的变化;采用MTT法,观察不同浓度的     

银鲳脾脏和肾脏组织细胞体外培养研究

为探究银鲳脾脏和肾脏组织细胞体外培养条件, 本研究采用组织块培养法对银鲳脾脏和肾脏组织进行原代培养. 实验选用DMEM/F-12、M199和DMEM等作为基础培养基, 在其中分别添加体积分数为10％、15％、20％的胎牛血清, 并添加青链霉素及庆大霉素以防细菌污染. 结果表明: 银鲳脾脏和肾脏组织在胎牛血清体积分数为20％的DMEM/F-12培养基中贴壁最好, 迁出细胞的种类最多, 细胞生长速度最快. 其中脾脏组织共迁出6种不同的细胞, 分别为: 免疫细胞、基质细胞、上皮样细胞、成纤维样细胞、造血灶和未知细胞; 肾脏组织共迁出3种细胞, 分别为: 上皮样细胞、巨噬细胞和成纤维样细胞.     

热致相分离法制备食道组织工程用支架的研究

合适的支架是进行组织工程研究必需的条件之一．运用自制的具有较好弹性的无规聚合物聚（L-乳酸-co-己内酯，PLLC），并采用热致相分离法（TIPS）制备了具有不对称孔径的食道组织工程用三维支架．经过对不同成孔条件（包括粗化温度、粗化时间以及聚合物溶液浓度等）的比较和研究，使此支架上表面具有孔径〈10μm，而本体具有50～100μm，甚至〉100gm的不对称多孔支架．并模拟正常食道粘膜层构造，将提取自猪食道的原代上皮细胞和成纤维细胞分别种植于此支架的二面，经HE常规染色，发现在体外培养时间（14d）内，在支架上表面已形成一连续层的上皮细胞层，某些部位甚至多于一层，这与正常食道的上皮细胞层相似．对于成纤维细胞而言，在与上皮细胞层同一视野内所见成纤维细胞较少，因为如果细胞生长在支架内部就很难用常规方法观察得到．但从这些结果可以看到用PLLC制备的多孔支架对细胞没有毒性，且具有一定的支持细胞生长的作用．     

不同栽培方式对笋瓜（印度南瓜）果实中主要品质指标质量比的影响

以‘龙圆栗香’为试材,采用地爬式和架式两种种植方式,利用单干、双干和三干3种整枝方式,研究不同栽培方式对笋瓜果实中果胶、戊糖和铬（Cr3＋）3种主要品质指标质量比的影响.结果表明：两种种植方式下三干整枝方式均不利于果实中果胶和戊糖的积累,地爬式栽培比架式栽培有利于果实中铬（Cr3＋）的积累;地爬式栽培双干整枝处理下果实内果胶质量比最高.可采用架式单干整枝处理方式来提高单位面积笋瓜果实中果胶、铬（Cr3＋）和戊糖的产量.     

紫草多糖对hCG诱导大鼠黄体细胞分泌功能的影响

采用体外黄体细胞培养,观察中药紫草的水溶成分——紫草多糖对hCG诱导的黄体细胞分泌孕酮影响,并探讨其可能机制。选取未成年雌性SD大鼠,分离黄体细胞,分为基础组和hCG组,分别添加不同浓度紫草多糖,放射免疫检测各组细胞内和培养液中的孕酮(Progesterone,P4)含量;将细胞悬液分为4组:空白对照组、1.50g.L-1紫草多糖组、2×104 U/L hCG组以及hCG(2×104 U/L)+紫草多糖(1.50g.L-1)组,在培养的不同时间点(0、0.5、1、2h时),分别测P4产量,观察紫草多糖对培养黄体细胞作用的起效时间和动力学变化。此外,上述4组培养0.5h后离心分离细胞和培养液,分别测得细胞内和培养液中的cAMP和cGMP含量,将细胞内和培养液中的含量之和作为总量,并计算其cAMP/cGMP比值。结果表明:1.紫草多糖呈剂量依赖性地抑制hCG刺激下黄体细胞P4的生成。2.加大剂量(>3.00g.L-1)紫草多糖亦可抑制基础P4的生成。3.1.50g.L-1紫草多糖组从作用0.5h起,即显著抑制黄体细胞hCG刺激下的P4生成(P<0.01)。4.hCG可明显增加黄体细胞cAMP含量,导致cAMP/cGMP增加。添加1.50g.L-1紫草多糖可增加cAMP、cGMP含量,但cAMP/cGMP比值下降。结论:紫草多糖可直接作用于促性腺激素的靶细胞——黄体细胞,并抑制hCG诱导黄体细胞分泌功能,该抑制作用起效快,并可能通过cGMP介导。     

香拯假种皮的结构及其芳香油研究

香榧(Torreya grandis Fort.ex Lindl.)是我国特有经济树种之一,其种子俗称香榧子,营养丰富,含油量高达54.39％,组成香榧油的脂肪酸中,以不饱和脂肪酸为主,占78.40％。香榧种子外面有一层很厚的肉质化假种皮,约占种子鲜重的50—60％。通常在种子堆放后熟过程中任其腐烂。假种皮中生长着许多树脂道,围绕树脂道有几层细胞,具有分泌芳香性物质的功能。现已从假种皮内提取出具有独特的类似格蓬香和膏树脂香的芳香油,可用于调制花香、清香型香精,在化妆品、肥皂、日用香料等行业中受到重视。     

感应反型层太阳电池的开路电压分析

本文应用数值计算方法研究了感应反型层太阳电池的开路电压与衬底掺杂水平、介质层固定正电荷密度及表面复合速度等的函数关系.研究结果表明,表面复合对开路电压的影响与衬底的掺杂水平有关,并且随着固定正电荷的增加而减弱.