银覆盖冠状硅柱阵列基底的制备、SERS特性分析及肿瘤标志物miRNA-106a的检测

以聚苯乙烯(PS)小球为模板,采用金属辅助刻蚀和湿法化学刻蚀技术,制备大面积冠状硅柱阵列,再原位生长银纳米粒子后得到银覆盖冠状硅柱阵列(Ag/Si CPA)基底。实验表明,制备的基底具有优良的表面增强拉曼散射(SERS)特性,电磁增强因子达到1.81×10~6。同时,将制备的罗丹明分子(R6G)标记的DNA发卡探针与基底链接,在与miRNA-106a互补杂交后进行SERS信号检测,获得相应的剂量-响应曲线。结果表明,基于(Ag/Si CPA)基底的SERS特性,开展miRNA-106a的检测,具有特异性好和灵敏度高的优势,检测范围为1 fmol·L~(-1)～100 pmol·L~(-1),检测极限为0.917 fmol·L~(-1)。此外,与实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)方法相比,不仅检测结果一致,而且基于SERS光谱技术的检测方法具有更高的灵敏度。     

基于空心海胆状金纳米粒子和银/氧化锌纳米结构SERS特性的基因类肿瘤标志物高灵敏检测

基因类肿瘤标记物microRNA(miRNA)的痕量检测对于癌症早期诊断具有重要应用价值.根据空心海胆状金纳米粒子和银/氧化锌(Ag/ZnO)纳米结构的表面增强拉曼散射特性,并基于碱基互补配对原理构建探针-核酸-基底组成的"三明治"结构,提出了一种基因类肿瘤标志物miRNA的高灵敏定量检测方案.首先将捕获DNA与修饰4-巯基苯甲酸(4-MBA)的空心海胆状金纳米粒子链接作为探针,同时在Ag/ZnO纳米结构上修饰靶DNA,经与miRNA-106a互补杂交后进行SERS信号检测,获得相应的剂量-响应曲线.实验结果表明,在1 fmol·L~(-1)至1 nmol·L~(-1)的检测范围内,对miRNA-106a的检测限达到1.84 fmol·L~(-1).同时,采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应方法验证了基于空心海胆状金纳米粒子和Ag/ZnO纳米结构SERS特性的miRNA检测方案的可靠性.     

基于酶剪切量子点荧光放大技术的双元miRNA定量检测

将量子点荧光特性与双链特异性核酸酶的DNA剪切特性相结合,提出一种高灵敏度、高特异性的双元miRNA定量检测方案.首先,将量子点和四氧化三铁磁性纳米粒子分别与捕获DNA链接形成捕获探针,再与待测miRNA互补配对形成异源双链杂合结构,随后双链特异性核酸酶对杂合结构中的捕获DNA进行特异性剪切,实现量子点和待测miRNA从捕获探针分离,且分离的待测miRNA与捕获探针上未配对的DNA开始新一轮杂交和再剪切.经过上述循环过程,量子点从捕获探针大量释放,荧光信号不断增强,实现肿瘤标志物miRNA的高灵敏检测.实验结果表明,基于酶剪切量子点荧光放大技术,在1fmol/L至100pmol/L的浓度范围内,同时实现了肿瘤标志物miRNA-141及循环miRNA内参miRNA-1228的特异性定量检测,其检出限分别达到0.69fmol/L和0.21fmol/L.与实时荧光定量多聚核苷酸链式反应方法相比,该方案获得了相同的检测结果,且具有更高灵敏度.     

基于金纳米杆/PMMA基底SERS特性的高灵敏肿瘤标志物无标记检测

高品质贵金属纳米结构基底的制备是应用表面增强拉曼散射(SERS)技术进行高灵敏生物检测的关键。采用改进的Langmuir-Blodgett方法,通过在金纳米杆(Au NRs)溶胶注入乙醇,使得Au NRs迁移至溶胶与甲苯的交界面,并用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)固定交界面处的Au NRs,形成大面积分布、均匀致密排列的二维畴状Au NRs/PMMA纳米结构薄膜基底。然后,采用等离子体清洗技术处理制备的基底,使得金纳米杆(Au NRs)的表面裸露,以增强基底的SERS特性。实验表明,Au NRs/PMMA基底具有优良的SERS特性,在785 nm波长的激光照射下,增强因子可以达到5.49×106。此外,利用制备的Au NRs/PMMA基底,开展前列腺癌症肿瘤标志物--前列腺特异性抗原(PSA)的高灵敏无标记定量检测研究。在PSA的无标记检测过程中,首先对PSA标准溶液和新生牛血清进行SERS光谱的直接检测,得到PSA分别位于823, 1 080, 1 385, 1 586和1 640 cm-1处的主要的拉曼特征峰;其次,通过对PSA标准溶液、临床男性血清样本及女性血清样本的SERS光谱进行测量和分析,筛选出在PSA的SERS光谱中与血清中PSA含量相关的拉曼特征峰,它们是分别位于649,680以及1 640 cm-1处的拉曼特征峰。进一步,通过对与PSA同属糖蛋白的肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)以及与PSA同源的人腺体激肽释放酶2(hK2)进行SERS光谱检测和分析,发现位于1 640 cm-1处的拉曼特征峰对于PSA具有高的特异性,将其作为临床血清样本中PSA无标记定量检测的具有特异性的拉曼特征峰,并以此为依据,对不同PSA浓度的标准溶液进行检测,得到位于1 640 cm-1处的拉曼特征峰强度与PSA样本溶液中PSA的浓度相关的剂量-响应曲线。最后,开展临床血清样本的应用检测。结果表明,基于Au NRs/PMMA基底的SERS检测结果与化学发光免疫分析(CLIA)方法的检测结果一致,且具有比CLIA更高的检测灵敏度,最低检测极限为0.06 ng·mL-1,且无标记检测范围为0.1 mg·mL-1～0.1 ng·mL-1。因此,基于Au NRs/PMMA SERS基底的高灵敏肿瘤标志物无标记检测具有重要应用前景。