基于核酸侵入反应偶联PCR的粪便样本基因甲基化定量分析方法及用于结直肠癌无创筛查

从粪便中检测BMP3基因甲基化水平可实现对结直肠癌的无创筛查,但对检测方法的灵敏度与特异性要求很高。本研究将核酸侵入反应与实时荧光聚合酶链式反应(PCR)偶联,建立了BMP3基因甲基化检测方法,以ACTB基因作为参比基因,通过优化反应体系中探针浓度、Flap核酸内切酶与Taq酶用量,提高BMP3目标基因与ACTB参比基因的扩增效率至接近100%,实现了利用ΔCT法进行BMP3基因甲基化水平的相对定量,可对低至10 copies的甲基化BMP3基因进行检测,并可从非甲基化模板中准确定量0.01%的甲基化模板,非甲基化模板不产生非特异性信号,表明本方法具有极高的灵敏度与良好的特异性。将本方法用于16例结直肠癌患者、7例结直肠腺瘤患者及19例健康人粪便样本中BMP3基因甲基化检测,结果表明,有5例结直肠癌患者的粪便样本检出BMP3基因甲基化,2例结直肠腺瘤患者的粪便样本检出BMP3甲基化,健康人的粪便样本均没有检出甲基化,表明本方法可用于检测粪便样本中基因的甲基化水平,为临床开展基于粪便中基因甲基化检测的无创结直肠癌筛查提供了新方法。     

实时荧光聚合酶链式反应偶联高特异性核酸侵入反应检测单核苷酸多态性

建立了实时荧光聚合酶链式反应( PCR)偶联高特性核酸侵入反应检测单核苷酸多态性( SNP)的方法。优化了体系中flap核酸内切酶1(FEN1酶)和野生型检测探针等用量,确定了最佳反应条件,即FEN1酶用量为1.5 U,野生型检测探针用量为0.125μmol/L,0.5μmol/L Invader突变型检测探针,各0.25μmol/L通用野生型( VIC)和突变型( FAM)荧光共振转移发卡探针,显著降低了野生型样本和突变型样本背景信号,避免了背景信号对检测结果分型的干扰。采用本方法对编码乙醛脱氢酶2( ALDH2)基因ALDH2*2位点21例样本、细胞色素P4502C19基因CYP2C19*2和CYP2C19*3位点各19例样本进行分型检测,结果表明, AL-DH2*2位点GG纯合10例,GA杂合8例,AA纯合3例;CYP2C19*2位点GG纯合9例,GA杂合8例,AA纯合2例;CYP2C19*3位点GG纯合18例,GA杂合1例。使用焦磷酸测序进行验证,两种方法检测结果一致。本方法特异性好、操作简便、耗时短、成本低,可实现对SNP单管闭管无污染的分型检测。