利用Pen a 1表位抗体亲和纯化目标蛋白的研究

以虾致敏蛋白Pen a 1(Tropomyosin)抗原表位为研究对象,建立了利用Pen a 1表位抗体亲和纯化致敏蛋白的新方法。Fmoc法合成致敏Pen a 1蛋白的C端含有3个抗原表位的第247~284位氨基酸对应的多肽片段,应用马来酰亚胺法将多肽与KLH(匙孔血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)偶联制备人工免疫抗原(Peptide-KLH)和人工包被抗原(Peptide-BSA),免疫人工抗原免疫纯种新西兰白兔,获得多克隆抗血清,抗血清经辛酸-硫酸铵及特异性血清纯化预装柱(HiTrap rProtein A FF)纯化后与溴化氰活化琼脂糖凝4B(CNBrActivated Sepharose 4B)进行偶联。ELISA(酶联免疫吸附试验)测定该多克隆抗体效价为2.05×106,多肽对抗体的IC50(50%抑制浓度)为0.21 mg/L,交叉试验表明该抗体与虾中非Pen a 1蛋白无交叉反应性;Bradford法测定CNBr-Activated Sepharose 4B与抗体的偶联率为90.76%。间接竞争ELISA测定1 mL偶联介质的吸附容量为2.84 mg Pen a 1,免疫亲和柱的加标回收率为89.6%~93.6%,亲和柱使用寿命为4次。     

虾过敏原Pen a1抗原表位的关键氨基酸分析

建立了一种利用表位抗体筛选虾过敏原Pen a1抗原表位中关键氨基酸的方法。利用生物信息学软件MEGA5计算Pen a1中表位的氨基酸组成和出现频率,并采用DNAMAN软件对SDAP数据库中致敏食物原肌球蛋白的氨基酸保守性分析,综合两种方法筛选出各表位可能的关键氨基酸,Epitope 1:K,E,N;Epitope2:K,L,E;Epitope 3:E,R,D,L,Q;Epitope 5:K,L,Q。用丙氨酸取代并合成突变多肽。利用表位抗体,通过竞争性免疫斑点法及间接ELISA方法检测突变多肽的抗体结合能力,筛选出各表位的关键氨基酸。分别为:Epitope1:谷氨酰胺;Epitope2:亮氨酸和谷氨酸;Epitope3:亮氨酸和天冬氨酸;Epitope5:亮氨酸。实验结果证明了此种筛选关键氨基酸的方法的可行性,为Pen a1致敏机理的研究及利用基因修饰脱敏提供了一定的理论依据。