超大孔离子交换制备色谱分离纯化高活性凝血因子VIII

建立了一条从人血浆中分离高活性凝血因子VIII(FVIII)的纯化工艺。基于FVIII和介质孔径的尺度比及其对蛋白质活性影响的分析,设计了以超大孔离子交换制备色谱为核心步骤的新型分离纯化工艺。分别进行超大孔离子交换色谱与传统离子交换色谱的条件优化,并对优化工艺所得产品进行了活性检测(底物显色法)和纯度检测(高效凝胶过滤和凝胶电泳)。结果表明,超大孔介质结构不但可以有效地保护蛋白质大分子结构,而且能够大幅度地提高制备色谱的传质速率,从而得到具有高凝血活性的FVIII产品。FVIII在超大孔制备色谱过程中的回收率(85%)比传统离子交换制备色谱高4～5倍,产品比活高达154 IU/mg。此外,还研究了超大孔介质的再生程序,采用5个柱体积的1 mol/L NaOH低流速清洗色谱柱,保证了色谱工艺的稳定性。本纯化工艺步骤简单,重现性好,易于放大生产。     

混合抗体的亲和色谱分离策略

乳腺生物反应器可以高效表达重组人单克隆抗体,但是目标产品与乳液原料中的牛抗体性质、结构非常类似,分离难度很大。本文对牛抗体和重组人抗体的种属差异进行了分析,并在此基础上制定了新型分离策略,采取Protein A亲和色谱和免疫亲和色谱来解决混合抗体的分离问题,并讨论了色谱洗脱模式对分离效果的影响。结果表明,Protein A亲和色谱结合梯度洗脱可以有效地纯化得到混合抗体,但是难以彻底分离重组人抗体和牛抗体;相比之下,使用Protein A亲和色谱结合置换色谱模式可以更加高效地分离混合抗体,最终可以得到纯度高达95%以上的重组人抗体,回收率可达95%以上。免疫亲和色谱同样可以有效地分离纯化重组单克隆抗体,且其通用性更强,可以应用于任何动物乳腺表达重组人抗体的分离纯化中。