F15L和K207E突变与Borrelia螺旋菌磷脂酰胆碱合成酶的生物活性

磷脂酰胆碱合成酶是磷脂酰胆碱合成酶(PCS)途径中的关键酶.根据Borrelia burgdorferiBB0249ORF的DNA序列设计引物对,从B.afzelii总DNA中扩增出一段660 bp DNA.序列分析发现扩增的DNA片段编码的蛋白中仅两个氨基酸(L15和E207)不同于B.burgdorferiBB0249 ORF编码的蛋白(F15和K207).将克隆的基因插入pET表达载体,并在大肠杆菌中表达.在活体中进行的活性分析发现,克隆的DNA片段编码的蛋白质能利用外源的胆碱和大肠杆菌细胞内的CDP-二酰基甘油合成磷脂酰胆碱(PC),表明螺旋菌磷脂酰胆碱合成酶15位的苯丙氨酸和207位赖氨酸残基分别被亮氨酸和谷氨酸替代并不影响磷脂酰胆碱合成酶的活性.     

推定的BB0462蛋白增强oppAⅤ启动子的转录活性

Borrelia burgdorferi基因组中BB0462 ORF编码一种由110个氨基酸组成的未知功能BB0462蛋白．使用推定的氨基酸序列在蛋白库中进行Blast比对以及推定蛋白的二级结构预测的结果都显示BB0462蛋白与YhaB家族的蛋白类似．共转化后β-半乳糖苷酶活性分析发现BB0462蛋白增强了B．burgdorferi lp54质粒携带的oppAⅤ上游调控区的转录活性，而对其他4个oppAⅠ～Ⅳ上游调控区调控区的转录活性没有影响．利用纯化的BB0462融合蛋白在体外分别与oppAⅠ～Ⅴ调控区DNA片段进行凝胶阻滞分析，发现BB0462蛋白仅与邻近oppAⅤ基因转录起始点的一段409bp上游调控区DNA结合．用未标记的oppAⅤ上游调控区DNA与DIG-标记的oppAⅤ上游调控区DNA竞争BB0462蛋白，使凝胶上的DNA迁移阻滞带完全消失．β-半乳糖苷酶活性分析和凝胶阻滞分析表明BB0462蛋白在oppAⅤ基因表达的转录调控中可能起重要作用．     

E.coli PC+PE-菌株AD93/ptac67的构建及其生物学性质

将螺旋菌Borrellia.afzelii编码的磷脂酰胆碱合成酶基因(pcs)导入磷脂酰乙醇胺阴性菌株E.coli AD93(PE-)获得磷脂酰胆碱阳性、磷脂酰乙醇胺阴性的菌株E.coli AD93/ptac67(PC+PE-).生理生化特性调查显示:AD93/ptac67菌株的生长需要高于10 mmol/L的Mg2+,而对照细菌AD93则需要高于20 mmol/L的Mg2+,AD93/pDD72菌株则不需要;AD93/ptac67与AD93 SDS的MIC值为0.02%,比AD93/pDD72低约10倍;5%NaCl完全抑制AD93/ptac67的生长,3%NaCl则几乎完全抑制AD93的牛长,而NaCl浓度为5%时,AD93/PDD72菌株仍能牛长;SDS-PAGE图谱显示3种菌株的周质蛋白差异显著,而外膜蛋白差异不明显.在活体细菌中,磷脂酰胆碱替代磷脂酰乙醇胺并不能使缺少磷脂酰乙醇胺的突变体恢复至野生型状态,显示磷脂酰胆碱不能完全替代磷脂酰乙醇胺的功能.     

抗HPV E7小鼠单克隆抗体与人类宫颈癌细胞的特异性结合

使用抗HPV E7蛋白的小鼠单克隆抗体进行Western blot杂交，发现3种人类宫颈癌细胞系CaSki、Hela S3和SiHa均表达一定量的HPV E7病毒蛋白，表达量由高至低依次为CaSki，Hela S3，SiHa．选取CaSki为代表，用荧光免疫标记法检测抗E7抗体分子与活体癌细胞中HPV E7蛋白结合的情况．结果发现，仅衰亡细胞、0．3％Triton X-100处理30min后的活细胞以及^137 Cs辐射处理后的活细胞显示荧光，暗示只有细胞膜通透性发生改变后抗E7小鼠单克隆抗体分子才能进入细胞与HPV E7蛋白特异地结合．流式细胞仪检测表明，与同型IgG抗体mAbS26相比，抗E7抗体分子与CaSki细胞作用时荧光标记细胞的净增百分率为16．5％，说明抗E7小鼠单克隆抗体分子与CaSki细胞结合具有特异性．