葛根素与胰蛋白酶相互作用研究

葛根素对胰蛋白酶有明显的抑制作用,D ixon作图法得出抑制常数Ki=8.15×10-5mol.L-1,抑制类型为非竞争性抑制。通过紫外吸收光谱,发现葛根素能改变胰蛋白酶的空间结构;由荧光光谱变化探索葛根素与胰蛋白酶的相互作用机理,发现荧光猝灭是能量转移引起的静态猝灭。     

溶胶凝胶膜包埋的胰蛋白酶用于高通量蛋白质肽谱分析

采用溶胶凝胶包埋法在96孔板中固定胰蛋白酶,制备高通量的酶解反应器。考察了四乙氧基硅烷(TEOS)与甲基三甲氧基硅烷(MTMS)的不同比例对凝胶膜的成胶速度、机械强度、透明度、固定酶的活性及稳定性的影响。以牛血清白蛋白(BSA)为目标蛋白,比较了溶胶凝胶固定化酶与溶液态酶的稳定性和催化活性,用HPLC对BSA的酶解产物进行了肽谱分析,比较了二者的酶解效率。结果表明,TEOS与MTMS比例为1∶1时,凝胶膜有很好的成胶速度、机械强度、透明度;包埋态酶有很高的活性和稳定性。HPLC对肽段的分析结果表明,固定化酶的酶解效率优于溶液态酶。     

壳聚糖固定化胰蛋白酶的研究

以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，采用两种方法制备了固定化胰蛋白酶。考察了固定化反应中pH值，戊二醛的浓度，以及给酶量对固定化胰蛋白酶活力的影响，并研究了这两种固定化胰蛋白酶的性质。实验结果表明，以戊二醛预交联的网状壳聚糖为载体制备的固定化胰蛋白酶具有更加优良的性能，在最佳固定化反应条件下，酶的活性加收率可达56％。此固定化胰蛋白酶的最适pH为7．0－8．5，最适温度为60℃，Km值为2．52mol/L，固定化胰蛋白酶表现出较好的热稳定性，pH贮存稳定性，以及在乙醇水溶液中的稳定性。     

大豆制品中胰蛋白酶抑制剂的抑制活性测定

胰蛋白酶对苯甲酰-dl-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐（BAPA）水解的催化作用受到胰蛋白酶抑制剂的抑制效应而使水解反应产物在410 nm波长处的吸收减弱,其减弱程度反映了有关胰蛋白酶抑制剂的活性。基础于此原理建立了测定胰蛋白酶抑制剂活性的紫外分光光度法。用大豆标准品验证了所提出方法的可行性和准确度,10次测定结果的标准偏差值为3.0%。分析了一件大豆样品,10次测定结果的平均值为2 527 TIU/g,RSD值为1.2%。     

荧光光谱法研究盐酸胍浓度不同时变性胰蛋白酶的构象变化

蛋白变性过程中间体的存在是蛋白变性及复性动力学研究中不可缺少的证据。以胰蛋白酶为模型蛋白 ,用荧光光谱法系统地研究了在不同浓度变性剂盐酸胍存在时胰蛋白酶构象的变化 ,并与活性数据进行了对比。发现胰蛋白酶荧光光谱发射波长随变性剂盐酸胍浓度增大而逐渐增大 ,并且当盐酸胍浓度达到 2mol·L- 1 时胰蛋白酶的最大发射波长达到最大值 ,其后随盐酸胍浓度的增大最大发射波长反而逐渐减小 ,当盐酸胍浓度大于 3mol·L- 1 呈现不变的趋势。也就是说 ,在低浓度变性剂环境下 ,胰蛋白酶存在着一个与天然态和完全变性态的分子构象都不同的中间体状态 ,这个中间体状态的荧光发射波长最大 ,荧光发射强度也最大 ,而以此状态为复性起点 ,最终得到的复性产率也最低。对此原因从分子结构的基础上进行了探讨。     

新型鳞片状聚合物修饰硅胶填料固定化酶的制备及其在蛋白质组鉴定中的应用

利用原子转移自由基聚合法制备了鳞片状聚合物修饰的硅胶填料,将其作为一种新型的固定化酶载体,实现了蛋白酶的高密度固定,从而明显缩短了复杂蛋白质样品的酶解时间。使用标准蛋白质对固定化酶的酶解效率进行了考察,结果表明: 鳞片状聚合物修饰的新型固定化酶硅胶填料具有较高的酶解效率,酶解标准蛋白质1 min后,鉴定到肽段的氨基酸序列覆盖率可达95%以上。将该固定化酶硅胶填料成功应用于大肠杆菌全蛋白质的酶解,从2 min酶解肽段的混合物中鉴定到的蛋白质数量超过同样条件下溶液酶解12 h的结果。另外,该固定化酶硅胶填料可以重复使用,其酶解效率具有良好的稳定性和重现性;该固定化酶具有较好的样品回收率,因而可以应用于蛋白质组学研究中。     

壳聚糖固定化胰蛋白酶的制备及理化性质研究

采用壳聚糖吸附和成二醛交联的方法,将胰蛋白酶固定于壳聚糖上．初步探讨了壳聚糖的脱乙酰度、交联剂用量及给酶量对固定化效果的影响,并对固定化酶的理化性质进行了研究．结果表明,用88％脱乙酰度壳聚糖0．2g,5％戊二醛2mL,8mg胰蛋白酶固定化效果较好;固定化胰蛋白酶的热稳定性较天然酶有较大提高,最适反应温度70℃,较天然酶提高了25℃;最适pH为7．0;表观米氏常数K’m为0．24％,天然酶Km为1．16％;室温下酪蛋白的半衰期为41d．     

复合纤维素膜固定化胰蛋白酶反应器及其应用于蛋白质酶解

合成了甲基丙烯酸缩水甘油酯-纤维素复合膜,并以此膜为基质共价键合固定化胰蛋白酶,以N-苯甲酰-L-精氨酰乙酯(BAEE)为底物,应用高效液相色谱系统测定了酶固定化膜柱的催化反应特性。研究结果表明:温度、pH值、离子强度、有机溶剂及蛋白变性剂等都对固定化酶的活力有一定的影响。在最适条件下,固定化胰蛋白酶的活力为17800U/g干膜,蛋白载量为3.6mg/g(≈0.15μmol/g)干膜,活性回收率达到52%.固定化酶表现出较高的使用和储藏稳定性,在40℃下,水解BAEE底物24h活力无显着变化。固定化酶膜柱在4℃冷藏保存100d仍保存90%以上的水解活力。固定化酶反应器被应用于蛋白质酶解的肽谱实验。     

胰蛋白酶降解骨胶原与明胶组份含量之间的关系

国内外的传统碱法制备明胶,无论是工艺还是最终产品质量,都已经达到了很高的水平,但仍存在很大的缺点,如浸灰周期长(一般1～2个月),生产效率低等。酶是一种有催化活性的蛋白质,能以非常低的浓度来增加正反应或逆反应的速度而不消耗自身。     

亲和色谱用无色合成配基对胰蛋白酶纯化功能的研究

考察了一种新型的阳离子无色三嗪化合物、几种阴离子无色三嗪化合物和三嗪染料作为亲和色谱配基对胰蛋白酶的吸附性能。猪胰蛋白酶经阳离子型配基一步纯化,比活达到１１６Ｕ／ｍｇ,纯化２１．６倍,回收率８８％。