圆二色谱研究Asp44在稳定肌红蛋白结构中的作用

为了了解肌红蛋白Mb分子表面44位天冬氨酸对稳定肌红蛋白结构的影响,用PCR定点突变的技术将肌红蛋白(Mb)基因上的第44位天冬氨酸的密码子GAT突变成赖氨酸的密码子AAA,获得突变体D44K基因,将突变体基因克隆在肌红蛋白表达质粒pGYM上,转化大肠杆菌BL21,突变蛋白D44K在大肠杆菌中大量表达,收集菌体。酶法裂解细菌,依次用硫酸铵沉淀、离子交换柱层析、凝胶柱层析分离纯化得突变肌红蛋白D44K。用圆二色谱分别研究野生型肌红蛋白及其突变体(D44K)的耐热及耐酸的变性过程。实验结果表明：用碱性氨基酸Lys取代酸性氨基酸Asp44残基,增强了肌红蛋白耐热变性能力,导致蛋白质的热变性中点温度T_m由71.9 ℃增加到75.1 ℃,但对肌红蛋白耐酸变性的能力影响不大。     

光谱法研究高铁肌红蛋白活性中心与咪唑的配位反应

采用紫外-可见(UV-Vis)、常规荧光、同步荧光等光谱法研究了高铁肌红蛋白(metMb)与咪唑的轴向配位反应的光谱性质。结果表明,metMb-咪唑配位体系的形成使得metMb的Soret带和Q带均发生红移;并对7位和14位2个Trp残基微环境极性的影响是不同的;同时还引起metMb活性中心铁卟啉597 nm处荧光增强,并且体系荧光强度与加入咪唑的浓度成线性关系,由此计算了不同温度下反应的配位数、结合常数及热力学参数;metMb与咪唑配体之间的配位反应是按物质的量比1∶1进行的;温度升高不利于配位反应的进行;热力学参数表明,此配位反应是自发进行的,焓变是整个配位反应的主要动力。     

酸诱导拥挤条件下肌红蛋白及突变体去折叠过程

采用紫外-可见吸收光谱、同步荧光光谱和圆二色(CD)光谱法研究拥挤试剂葡聚糖70 (Dextran70)和聚蔗糖70 (Ficoll70)存在条件下, 酸诱导野生型肌红蛋白Mb(WT)及其突变体Mb(D60K)的去折叠过程. 结果显示: 在Dextran70 和Ficoll70 两种拥挤环境下, Mb(WT)的变性中点pH值由4.25 分别降低到3.78 与3.76, 拥挤试剂加入后增强了Mb(WT)的耐酸能力; 肌红蛋白60位天冬氨酸(Asp)突变为赖氨酸(Lys)后, 变性中点pH值由4.25 降低到4.19, 耐酸性比野生型肌红蛋白有所增强, Mb(D60K)在Dextran70 和Ficoll70 两种拥挤环境下变性中点pH值由4.19 分别降至3.74 和3.12. 以上实验说明肌红蛋白表面氨基酸突变和拥挤试剂的添加起到了稳定血红素微环境、芳香族氨基酸及二级结构和保护蛋白天然状态的作用.     

光谱法研究肌红蛋白与亚硝酸钠的相互作用

采用紫外-可见光谱、荧光光谱、同步荧光光谱和圆二色光谱法研究了肌红蛋白与亚硝酸钠配位反应的光谱学性质.结果表明,肌红蛋白与亚硝酸钠配位反应的进行与血红素中心铁原子的价态有关;当肌红蛋白活性中心Fe为三价时,亚硝酸钠主要与蛋白质上的氨基酸发生作用.而当肌红蛋白的活性中心Fe为二价时,亚硝酸钠则与卟啉铁配位,形成亚硝基亚铁肌红蛋白.荧光光谱表明亚硝酸钠的加入改变了肌红蛋白氨基酸残基的微环境,同步荧光光谱数据显示肌红蛋白与亚硝酸钠作用位点更接近于色氨酸残基,同时CD数据也表明肌红蛋白与亚硝酸钠作用后,其α-螺旋含量降低了19.33%,二级结构发生明显变化.     

光谱法研究高铁肌红蛋白活性中心与一氧化氮的配位反应

蛋白质与配体作用的瞬时性对调节生物功能的正常发挥至关重要。采用紫外-可见吸收光谱法(UV-Vis)和圆二色光谱法(CD)研究了高铁肌红蛋白(metMyoglobin,metMb)与一氧化氮的配位反应过程,论证了metMb与NO配位反应机理以及影响配位反应的因素。结果表明：metMb能与NO发生配位反应,420,534和568 nm处特征峰的出现,表明metMb与NO结合并生成一种新的配合物——亚硝基高铁肌红蛋白(nitrosylmetmyoglobin,metMbNO)。随着时间的推移,溶液中NO浓度逐渐减小,metMbNO配合物中Fe—N配位键在大量H₂O分子的进攻下断裂,NO慢慢地脱离,metMbNO配合物完成解离过程并重新生成metMb。实验中还发现metMb与NO配位反应的进行受到缓冲介质类型、离子强度、pH及温度等外界因素的影响。并且在0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液近中性条件时,metMb与NO配位反应最先达到平衡;当温度较低为280 K时,更易于metMb与NO配位反应的进行。此外,CD数据表明NO只与metMb血红素中心的铁原子发生配位反应而对蛋白二级结构影响甚微。探讨metMb与NO配位反应机制对于进一步研究生物体内NO功能的发挥有着重要的指导意义。     

氢卟啉, N-/Neo-混杂卟啉结构和吸收光谱性质的密度泛函理论研究

卟啉类化合物是一类重要的光化学材料,其衍生物特殊的光电特性在各个领域中得到了广泛的应用。利用密度泛函理论(DFT)研究了(free base porphyrin, FBP)及其异构体(neo-confused porphyrin, NECP)和(n-confused porphyrin, NCP)三种卟啉环的几何结构和分子轨道能级。采用TDDFT方法计算真空和溶剂场极化连续模型下三者的吸收光谱。计算表明由于N原子位置变化,FBP,NECP和NCP在Soret带和Q带两个特征吸收峰也有不同。按FBP,NECP和NCP顺序,分子轨道能级LUMO依次降低,HOMO轨道依次升高,从而造成吸收光谱红移。HOMO和HOMO-1轨道能级的分裂造成了FBP和NECP的Soret带的多个吸收峰,而NCP的LUMO和LUMO+1 的能级差与其HOMO和HOMO-1能级差几乎相等造成Soret带只有一个最高吸收峰。计算结果表明不同溶剂(苯、氯仿、乙腈和水)条件下三者的Soret带和Q带特征吸收峰均有显著变化。为此重点讨论了N原子位置的变化及在不同性质溶剂下FBP,NCP和NECP三类化合物Soret带/Q带吸收光谱性质的变化规律和机理。     

大分子拥挤条件下光诱导细胞色素C还原的光谱研究

稀溶液中高铁细胞色素C（ferric cytochrome c,Fe（Ⅲ）-Cyt c）能被光照还原成亚铁细胞色素C（ferrous cytochrome c,Fe（Ⅱ）-Cyt c）,但这一研究忽略了生物体细胞的真实环境是高度拥挤的,因此采用紫外可见、同步荧光及圆二色谱光谱法研究了大分子拥挤环境中光诱导Cyt c的还原过程及其对外界环境的依赖情况. UV-Vis光谱和同步荧光光谱结果表明,拥挤试剂葡聚糖70（Dextran70）和聚蔗糖70（Ficoll70）的加入利于Cyt c光还原的进行,且Ficoll70存在时Cyt c光还原程度远高于Dextran70存在时;Dextran70和Ficoll70环境中光诱导Cyt c还原的最适温度分别为37 ℃和25 ℃,定波长280 nm光照射利于Cyt c还原;Cyt c的光还原程度随着Dextran70浓度增加而增大,Ficoll70环境中Cyt c的最适光还原浓度为100 g·L^-1;拥挤环境下Met,Trp,Tyr和Phe的存在对光诱导Cyt c的还原过程依Phe> Tyr> Trp> Met顺序有催化促进作用;CD光谱结果表明光照射稀溶液中Cyt c蛋白还原后,其α-螺旋含量降低,β-折叠含量升高,而光照射拥挤环境中Cyt c还原后蛋白的二级结构基本没变化. 结果表明拥挤试剂具有稳定蛋白质二级结构的作用,且影响光还原Cyt c的电子传递过程及效率.     

长春新碱与牛血清白蛋白相互作用研究

利用紫外、荧光和圆二色光谱研究了不同温度下长春新碱(VCR)与牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用。通过荧光猝灭数据算得在 296,303和310 K时,VCR与BSA的猝灭常数K_SV分别为2.0×104,1.7×104和1.5×104 L·mol-1,结合常数K_a分别为1.5×104,9.5×103和4.9×103 L·mol-1,结合位点数分别为0.978 6,0.949 0和0.891 1,表明VCR与BSA间具有较强的结合作用,但结合能随着温度的升高而降低,是形成复合物的静态猝灭。圆二色光谱 (CD)数据表明相互作用后BSA的二级结构发生了改变：BSA的α-螺旋的含量从33.5％下降到 29.7％,β-折叠的含量从13.6％升高到18.4％。通过Van′t Hoff方程,计算出热力学常数焓变(ΔH)和熵变(ΔS) 分别为：－62.7 kJ·mol-1和－129.38 J·（mol-1·K）－１,表明氢键和范德华力在VCR与BSA结合中处于主导作用。     

长春新碱与人血清白蛋白的相互作用研究

利用荧光和圆二色光谱研究了长春新碱(VCR)与人血清白蛋白(HSA)之间的相互作用. 通过荧光猝灭测得在288, 298和308 K时, VCR与HSA的结合常数K分别为2.14×10⁴, 1.73×10⁴ 和1.35×10⁴ L•mol^－1, 表明VCR与HSA间具有较强的结合作用, 属于静态猝灭. 计算出焓变(ΔH)为 －17.38 kJ•mol^－1, 熵变(ΔS)为22.62 J•mol^－1•K^－1, 结合分子模型理论计算的结果, 表明VCR与HSA相互作用时在色氨酸(Trp) 214残基和VCR分子中吲哚基间作用力以疏水作用力为主, 但在 VCR和HSA 分子间以静电引力为主. 圆二色光谱(CD)的数据表明相互作用后HSA的二级结构发生了改变：HSA的α-螺旋的含量从51.7%下降到32.9%, β-折叠的含量增加了9.2%.