完整糖基化肽段的富集与质谱解析新技术研究进展

蛋白质糖基化是生物体内最重要的翻译后修饰之一,在蛋白质稳定性、细胞内和细胞间信号转导、激素活化或失活和免疫调节等生理过程和病理进程中发挥重要作用。而异常的蛋白质糖基化往往和多种疾病的发生发展密切相关,目前应用于临床检测的多种肿瘤生物标志物大多属于糖蛋白或者糖抗原。因此在组学层次系统分析蛋白质糖基化的变化对阐明生物体内糖基化修饰的调控机理和发现新型疾病标志物都非常重要。基于质谱的蛋白质组学技术为全面分析蛋白质及其修饰提供了有效的分析手段。在自下而上的蛋白质组学研究中,由于完整糖基化肽段同时存在性质各异的肽段骨架和糖链结构、糖肽的相对丰度和离子化效率较低以及糖基化修饰有高度异质性等特点,完整糖肽的分析比其他翻译后修饰更加困难。近年来,为了更全面、系统地分析蛋白质糖基化,研究人员发展了一些新技术,包括完整糖肽的富集技术、质谱的碎裂模式和数据采集模式、质谱数据的解析方法和定量策略等等,大力推进了该领域的研究水平,也为研究蛋白质糖基化相关的生物标志物提供了技术支持。该篇综述主要关注近年来基于质谱的糖蛋白质组学研究中的新进展,重点介绍针对完整N-和O-糖基化肽段的富集新技术和谱图解析新方法,并讨论其在肿瘤早期诊断方面的应用潜力。     

基于三甲基苯磺酰羟胺消除反应的氧连接氮乙酰葡萄糖胺修饰肽段的精准鉴定

氧连接氮乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)是一种重要的蛋白质翻译后修饰,它在维持机体正常的生命活动中发挥着重要作用。许多研究证实,O-GlcNAc糖基化修饰稳态的破坏与人类多种疾病的发生相关,大规模富集鉴定O-GlcNAc糖基化修饰蛋白有助于发现新的临床疾病诊断标志物。由于O-GlcNAc糖基化修饰丰度较低,形成的糖苷键不稳定,O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定面临一定挑战。近年来,全乙酰化的非天然糖代谢标记技术被广泛应用于O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。然而,最新的研究发现,在细胞代谢标记过程中,全乙酰化的非天然单糖会同时标记半胱氨酸的巯基而引入半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该副反应在一定程度上干扰了O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集鉴定。鉴于此,研究发展了一种通过三甲基苯磺酰羟胺(MSH)特异性氧化消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物的方法,进而显著提高O-GlcNAc糖基化修饰肽段的精准鉴定。该方法建立于温和的磷酸钠缓冲液(50 mmol/L, pH=8)体系,利用过量的MSH,于95 ℃避光振荡反应30 min,可完全消除半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物。该方法应用于Hela细胞中,可有效消除叠氮全乙酰化半乳糖胺(Ac₄GalNAz)代谢产生的半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物,从而成功富集鉴定到157条O-GlcNAc糖基化修饰肽段,归属于130个蛋白质。该方法有效去除了半胱氨酸巯基-叠氮糖人为修饰物对代谢标记结果的干扰,为非天然糖代谢标记技术在糖蛋白组学分析中的应用提供了新的研究策略。     

核糖核酸-蛋白质复合物规模化富集与鉴定技术的研究进展

核糖核酸(RNA)在细胞中并非单独存在,从它们产生到被降解的过程中与大量蛋白质发生相互作用,RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)能与RNA结合形成RNA-蛋白质复合物(RP复合物),并以这种复合物的形式发挥生理功能。RNAs或RBPs任一组分的异常与缺失都会影响RP复合物的正常生理功能,从而导致疾病的发生,如代谢异常、肌肉萎缩症、自身免疫性疾病和癌症。因此,定性定量分析RBPs及其在正常细胞和肿瘤细胞中与RNAs靶标之间的复杂相互作用网络有助于挖掘RP复合物在肿瘤发生发展中的作用,开发肿瘤生物标志物和新的治疗方式。要深入研究和理解RNAs与RBPs的相互作用网络,须依赖组学技术对RP复合物进行大规模鉴定。而作为在组学层面系统性解析RP复合物组成、含量和功能的第一步,大规模富集RP复合物极具挑战性。为了解决这一难题,研究者们发展了各种富集鉴定策略。该文针对RP复合物富集策略的最新进展进行了综述,包括紫外光交联和免疫沉淀(crosslinking and immunoprecipitation, CLIP)及其衍生技术、基于“点击化学”的富集策略和基于相分离的富集策略,比较分析了它们的技术原理、优缺点,以方便研究者们选择合适的策略来解决感兴趣的生物学问题。该文最后总结了当前的RP复合物富集方法仍然存在富集效率低和操作繁琐等亟需解决的技术挑战,为富集策略的发展提供了研究方向。     

基于TMT10-plex等量标记结合SMOAC富集磷酸肽的定量磷酸化蛋白质组性能评价

探索并建立了一种快速、 简便且高通量定量磷酸化蛋白质组的策略, 即采用连续互补的磷酸化富集方法SMOAC(Sequential enrichment of metal oxide affinity chromatography)结合TMT(Tandem mass tag)标记技术定量磷酸化蛋白质组学. 以3例经紫草素处理的及3例正常的人肝癌 HepG2 细胞为实验材料, 经Trypsin酶解后的肽段用TMT10-plex试剂进行等量标记, 标记肽段先经TiO₂富集, 收集包含磷酸化肽段的洗脱液, 接着用次氮基三醋酸铁(Fe-NTA)对TiO₂的流穿液和清洗液进行二次富集, 再次收集包含磷酸化肽段的洗脱液. 整个实验流程做2组, 对其中一组的2次洗脱液分别分析, 另一组的2次洗脱液合并分析. 在SMOAC的2次洗脱液合并分析中鉴定到4263个磷酸化蛋白上超过13000条磷酸化肽, 富集特异性>97%, 其中被定量的磷酸化蛋白为3848个, 占总鉴定量的90%以上. 研究结果表明, SMOAC 能够有效提高磷酸化肽段的鉴定效率, 且能与TMT等量标记试剂结合, 实现对少量蛋白样品的磷酸化蛋白定量分析.     

改性介孔材料制备及其对低分子量蛋白质的在线选择富集研究

制备了3种内外表面修饰不同官能团的硅基介孔材料,采用傅立叶变换红外光谱对修饰后材料的官能团进行了表征,并采用高效液相色谱对材料选择性富集低分子量蛋白质的能力进行了考查。3种材料对低分子量蛋白质和小肽均具有选择性富集能力,其中乙烯-二醇材料的富集能力最好。采用乙烯-二醇介孔材料装填预柱,考察了其对低分子量蛋白质的在线富集能力。高分子量蛋白质(卵清蛋白,分子量43000Da)在该预柱上没有保留,在死时间里直接流出柱外,而低分子量蛋白质(胰岛素,分子量5700Da)在该预柱上得到了较好的选择性萃取。保留在柱上的低分子量样品通过提高流动相中的有机相含量进行洗脱。研究工作对低分子量蛋白质和小肽的在线富集提供了一种新技术。     

水溶性硼酸亲和富集材料的制备及基于酶联免疫吸附法检测人肝微粒体糖蛋白的应用

生物样品中的糖蛋白丰度低,且在检测中易受到其它非糖蛋白的抑制和干扰,需在分析检测前对糖蛋白进行富集,但常规的基于固相材料的糖蛋白富集方法不易与生物技术中最经典的酶联免疫吸附法(ELISA)兼容.本研究以树枝状聚合物PAMAM 4.0为载体, 结合硼酸亲和技术,制备了新型水溶性硼酸亲和富集材料(DBC),并将其应用于基于ELISA的人肝微粒体中糖蛋白的检测.采用标准糖蛋白对DBC富集条件进行优化,然后考察其灵敏度和抗干扰能力,将优化后的方法应用于复杂样品人肝微粒体糖蛋白富集.结果表明,DBC对糖蛋白的富集选择性可高达100000倍,可将糖蛋白的富集信号提高100倍.以DBC为富集材料,与ELISA分析技术相结合,只需一步简单的孵育,即可实现生物样品中糖蛋白的高灵敏度、高选择性检测,为疾病相关的糖蛋白组学研究提供了一种有效的检测手段.     

印度洋热液区贻贝及栖息沉积物中金属元素的特征分析

本研究采集了印度洋热液区贻贝生物及其栖息沉积物样品,分析了生物体及沉积物中常见微量元素及稀土元素的含量与分布特征,研究了生物体与沉积物金属元素的相关性,以及稀土元素的生态化学特征等.结果表明:印度洋热液区沉积物中常见微量金属主要为Fe(96.62 mg/kg)、Mn(1.143 mg/kg)和Zn(322.6 μg/kg),微量元素归一化计算得Fe含量比值高达98.15%,可获悉该热液区沉积物主要为铁矿类物质.深海贻贝中微量元素及稀土元素的分布趋势与深海沉积物中元素分布存在较好的相关性,相关性系数分别为0.991与0.996,近海贻贝中金属元素的含量及分布与深海贻贝存在差异性.深海沉积物与贻贝中轻重稀土元素均呈现分馏现象,且贻贝中富集轻稀土比较显著;从稀土配分模式可知,沉积物与贻贝中的Eu与Gd均呈现异常现象,深海沉积物和深海贻贝中Eu异常现象较为显著.深海沉积物、贻贝及近海贻贝中δEu分别为9.50、10.68和0.23,而δCe分别为2.21、2.71和4.38,表明近海贻贝中稀土元素富集来源与深海贻贝存在差异性,深海沉积物与深海贻贝稀土元素具有同源性.     

中空纤维分散液膜富集稀土元素

采用2-乙基己基膦酸单-2-乙基己基酯(HEHEHP)-正庚烷为萃取剂,盐酸为反萃取剂,中空纤维膜作支撑膜,研究中空纤维分散液膜技术富集稀土镱(Yb~(3+))离子。考察了体系物性:反萃分散相中反萃剂浓度、萃取剂浓度、萃取剂与反萃剂体积比、料液相p H值、稀土离子浓度;流体流动状态:反萃分散相与料液相流速变化等因素对富集稀土离子的影响。中空纤维分散液膜富集Yb~(3+)的最佳条件为:萃取剂浓度为0.25 mol/L,反萃取剂HCl浓度为4.00 mol/L,萃取剂与反萃剂体积比为10∶40,料液相p H=2.80,稀土离子浓度为0.025 mol/L。反萃分散相体积流量和料液相体积流量较小时,萃取率随流量的增加呈现逐渐增大的趋势。若两相体积流量过大,反萃过程进行不完全,萃取率反而下降。研究结果表明,中空纤维分散液膜技术可实现稀土离子的有效富集。