甘蓝型油菜抗(耐)菌核病近等基因系的创建及抗病性分析

以抗 (耐 )菌核病显著强于中油 82 1的中R 888、中R 783、宁RS 1作供体亲本 ,中油 82 1作受体亲本和回交亲本创建了甘蓝型油菜抗菌核病的近等基因系 经离体叶片接种菌核病菌抗性鉴定 ,结果表明 3个近等基因系 (NIL)与回交亲本抗菌核病差异极显著 (P <0 .0 1) ,其中以供体亲本中R 888品系抗病性最强 ,NIL的抗病性强弱的排列顺序与抗性亲本的相一致 油菜种子带菌率的测定结果显示 (中油 82 1×中R 888)BC5的带菌率为 0 也与供体亲本的带菌率大小顺序相一致 随机选择的油菜品种 (系 )种子中游离脯氨酸含量分析 ,结果表明 3大类型油菜的脯氨酸含量差异极显著 ,芥菜型油菜 >NIL(甘蓝型油菜 ) >白菜型油菜 >极感病甘蓝型油菜 .     

修饰的Ac/Ds转座子元件在油菜中的遗传转化与鉴定

玉米Ac/Ds转座子系统已被成功应用于多种异源植物进行基因的分离与克隆.本研究利用农杆菌介导法将含有Ac元件的质粒pUbiAc及含有Ds元件的质粒pDsBar1300分别转化甘蓝型油菜中双6号的子叶柄与下胚轴,分别获得了Ac和Ds的转化植株.PCR检测发现,在10株Ac转化植株中有1株为阳性苗,阳性率为10%;在28株Ds转化植株中有21株阳性苗,阳性率为75%.该结果为下一步构建油菜突变体群体及开展油菜功能基因组学研究将开辟一个新的途径.     

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)cbn1和cao突变基因的对比分析及CAO基因的分子定位

用电击法将带有CAO基因片段的P sp109-E 8质粒转入到莱茵衣藻cbn1-48m t 基因突变株中后,转化子中出现了叶绿素b的恢复性表达,初步验证了丧失合成叶绿素b能力的cbn1和cao突变基因具有等位性的属性;将1641-1b(cbn1-43 m t )和CC-1354(cbn1-48 m t )突变株分别与CBS5(cao5 m t-)突变株的分离子CBS5-c1和CBS5-c5进行杂交,并通过随机分析方法分离获得1842个减数分裂后代分离子,经检测其中均没有发现有野生性表型的分离子,初步证明cbn1和cao 4突变基因间有着非常紧密的连锁性;从上述杂交系分离获得的50多个四分子中也没有检测发现显示野生性表型的分离子,进一步证明了cbn1和cao突变基因具有等位性的属性;根据CAO基因的DNA序列,从5′-端和3′-端设计两个探针,分别与莱茵衣藻核基因组Ⅰ号染色体上GBP 1和RB 47分子标记之间的21个BAC克隆进行的点杂交实验结果显示,该两个探针序列与21号BAC克隆(莱茵衣藻BAC文库序列号33e2)片段均有同源区的特性,此项DNA杂交实验初步证明,CAO基因的位点是在cbn1突变基因左右两侧的GBP 1和RB 47两个分子标记之间的33e2 BAC克隆片段区.     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。