p16蛋白对B型流感病毒诱导HeLa细胞凋亡的影响

以流感病毒 B/沪防 93- 1株感染 He L a细胞 ,通过 Hoechst332 5 8荧光染色、琼脂糖凝胶电泳分析检测细胞凋亡 ,并用免疫组化技术测定 p16蛋白的表达 ,探讨 p16蛋白表达对 He L a细胞凋亡的影响 .结果表明 ,B型流感病毒感染 He L a细胞可诱导其凋亡 ,感染 2 4h后 ,细胞凋亡数达 84.5 % ;He L a细胞凋亡伴随 p16蛋白的表达 ,2 4h达高峰 ,阳性率为 49.2 3± 1.70 .研究结果提示 ,B型流感病毒感染诱导 He L a细胞凋亡过程与 p16基因激活相关 ,p16蛋白可能是介导流感病毒诱导细胞凋亡的另一重要途径 .     

控制细胞生死的一把新钥匙TRAIL

TRAIL是最近克隆的 TNF家族中的一个新成员 ,其最显著的特异性是 :能迅速诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无影响 .其受体和竞争受体的多样性表明 TRAIL具有与 TNF不同的控制细胞死亡的独特机制 ,TRAIL通过与不同的细胞表面特异性受体结合来调控死亡信号的转导过程 .研究表明 ,TRAIL对肿瘤的杀伤效率高 ,特异性强 ,是一个很有潜力的抗肿瘤细胞因子 .     

蛙虹彩病毒cop基因的克隆表达及亚细胞定位

从蛙虹彩病毒(Rana gryliovirus,RGV)基因组中克隆了含凋亡相关结构域的新基因-cop(Caspaserecruit ment domain only protein,COP)基因的全部编码区,成功构建了重组表达载体,进行了原核表达,并在鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosumcyprini,EPC)中进行了亚细胞定位.序列分析表明,RGVcop基因全长288 bp,编码一个长为95 aa,分子量为10.4×103的推定蛋白.二级结构预测表明其含有5个α螺旋.同源性比对分析显示,RGVcop与其他6株虹彩病毒及人类cop相关蛋白同源性最高为94%,最低为33%.重组原核表达质粒pET28a-COP转化大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导表达,获得一条约14×103的融合蛋白.重组真核表达质粒pEGFPN3-COP转染EPC细胞,经DAPI染色后,在荧光显微镜下观察显示重组蛋白在整个细胞中均有分布.     

大蒜素对人卵巢癌SKOV3/DDP细胞增殖与凋亡的影响及机制

探讨大蒜素(DT)对人上皮性卵巢癌SKOV-3/DDP细胞的增殖抑制及诱导其细胞凋亡的分子机制。用人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV-3/DDP细胞随机分为4组:①正常对照组;②DT组:于培养基中加入DT(终浓度分别为5、10、20、40μg·mL-1)分别作用细胞24、48和72h;③顺铂(DDP)组(5μg·mL-1);④DT+DDP组(20μg·mL-1 DT和5μg·mL-1 DDP)。MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-PCR和Western blot分别检测基因bax、bcl-2的mRNA和蛋白表达。与正常对照组比较,DT组SKOV-3/DDP细胞增殖抑制率与凋亡率均有显著的增加(P0.05),且作用呈剂量和时间依赖性,Bax mRNA和蛋白表达上调,Bcl-2mRNA和蛋白表达下调(P0.05);与DT或DDP组比较,DDP+DT组的细胞生长抑制率及凋亡率均有显著增加(P0.05),且Bax mRNA及蛋白表达上调,Bcl-2mRNA和蛋白表达下调的程度大于单用组(P0.05)。大蒜素对SKOV-3/DDP细胞有显著的抑制增殖和促凋亡的作用,增加SKOV-3/DDP细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与大蒜素调控Bax/Bcl-2蛋白表达有关。     

低温处理增强紫外照射诱导HeLa细胞凋亡

报道了紫外照射诱导体外培养的HeLa细胞凋亡的研究结果,对亚致死低温处理增强紫外照射诱导细胞凋亡的可能性进行了探讨.结果显示HeLa细胞经紫外线照射l0min后培养6h,细胞凋亡指数明显升高,并于照射后30～36h达到高峰(44.82%～70.97%).荧光显微镜下观察可见细胞核固缩、碎裂,DNA凝胶电泳出现特征型的梯状图谱;低温处理后立即照射,可明显增加细胞凋亡指数.但此效应是暂时性的,将4℃处理了12h的细胞恢复于37℃培养24h再行照射,细胞凋亡指数与纯照射组相比并无明显改变(P＞0.05).     

LTB-hpaA融合基因原核表达产物的鉴定及其免疫保护作用

分别从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中扩增ltB和hpaA基因,构建ltB-hpaA融合基因及其原核表达系统,鉴定其表达产物的免疫原性、佐剂活性及其对Hp SS1株感染小鼠的保护作用.采用PCR分别从上述菌株DNA中扩增hpaA基因和ltB基因片段,构建ltB-hpaA融合基因,T-A克隆后测定核苷酸序列.采用质粒pQE32和宿主菌E.coli M15构建ltB-hpaA融合基因表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导表达.采用western blot和GM1-ELISA鉴定表达产物的抗原性、免疫反应性和佐剂活性.建立HpSS1株感染BALB/c小鼠模型,检测rLTB-HpaA的免疫保护效果.采用ELISA检测125例胃、十二指肠粘膜活检标本尿素酶阳性患者血清中HpaA抗体和41株Hp临床菌株HpaA表达情况.与GenBank登录的相关序列比较,所构建的ltB-hpaA融合基因核苷酸序列同源性分别为94.25%～99.71%和95.38%～99.19%.所构建的表达系统pQE32-ltB-hpaA-M15的目的重组蛋白(rLTB-HpaA)表达量高达细菌总蛋白的1/3左右.rLTB-HpaA能与Hp全菌抗体发生结合反应,免疫家兔能产生特异性抗体.GM1-ELISA结果显示rLTB-HpaA能与牛GM1结合.rH-paA免疫小鼠的保护率仅为66.7%,rLTB-HpaA免疫小鼠的保护率可增至83.3%.81.6%患者血清(102/125)HpaA抗体检测结果阳性,所有菌株均含有HpaA.本文成功地构建了itB-hpaA融合基因高效原核表达系统,所表达的rLTB-HpaA有良好的免疫原性和佐剂活性,并对Hp感染小鼠有较强的免疫保护作用.     

顺铂对肝癌SMMC-7721干细胞标志物的影响

目的探讨顺铂(cisplatin,DDP)对肝癌SMMC-7721细胞增殖、周期和干细胞标志物ABCG2、CD133及ICAM-1蛋白的影响.方法不同浓度(32 mg/L、16 mg/L、8 mg/L、4 mg/L、2 mg/L)DDP作用于SMMC-7721,采用MTT比色法测定细胞增殖能力;PI染色后流式细胞仪检测细胞周期;免疫荧光法检测三种干细胞标志物表达水平.结果不同浓度DPP均对SMMC-7721细胞增殖产生抑制作用(P0.05).4 mg/L和2 mg/L DPP作用48 h使处于G0/G1期SMMC-7721细胞明显减少,S期细胞显著增多(P0.05).DPP作用后残存细胞中三种干细胞标志物(ABCG2、CD133及ICAM-1)表达增多.结论 DPP抑制SMMC-7721细胞增殖,阻滞细胞于S期.提示可能存在逃避DPP作用的肿瘤干细胞,为有效降低临床肿瘤复发率提供一定的理论基础.     

纳米二氧化硅体内与体外氧化应激及细胞毒性实验研究

研究了纳米二氧化硅(SiO2)体内及体外氧化应激损伤及细胞毒性作用及机制.体内实验采用ICR小鼠,纳米SiO2经口灌胃染毒3次,检测肺组织中MDA(丙二醛)和SOD(超氧化物歧化酶)含量,观察纳米SiO2对小鼠肺的氧化应激毒性.采用体外培养的小鼠上皮细胞(JB6细胞),观察不同质量浓度纳米SiO2染毒后的细胞形态改变,通过蛋白免疫印迹实验检测纳米SiO2是否通过FAS信号途径引起细胞凋亡.研究结果表明:纳米SiO2经口染毒后对小鼠肺具有氧化应激损伤作用,表现为随染毒剂量的升高,肺组织中MDA产生量增加,呈一定的剂量-反应关系.同时,肺组织内SOD水平总体趋势降低,但是差别未见统计学意义.体外培养细胞实验中,纳米SiO2染毒后可引起细胞出现凋亡并呈空泡样变.蛋白免疫印迹实验中,纳米SiO2可引起FAS信号蛋白表达量明显上升,但是FADD表达水平并不升高.     

重组甲鱼载脂蛋白B的研制及其阻断STSSSV感染的活性初探

为了制备甲鱼(Pelodiscus sinensis)载脂蛋白B (Pelodiscus sinensis Apolipoprotein B, PApoB) 基因的原核表达产物, 并探索其是否具有阻断甲鱼系统性败血症球状病毒(Soft-shelled Turtle Systemic Septicemia Spherical Virus, STSSSV)感染的功能, 为最终控制和防治甲鱼系统性败血症疾病奠定基础, 构建了PApoB的原核表达系统, 纯化了重组PApoB, 并将其用于阻断STSSSV感染的分析: 根据甲鱼PApoB的基因序列, 设计引物, 扩增其第9932-11209bp(3294-3696 aa)区段, 将其连接至表达载体pET-28a(+)中, 转化大肠杆菌Rosetta株, 经硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达, 并用亲和层析法纯化获得了重组PApoB; 将FITC标记的STSSSV与PApoB孵育后对甲鱼细胞进行攻毒, 显微镜下观察, 结果PApoB添加组的病毒荧光信号明显低于非添加组, 表明该重组蛋白可以阻断STSSSV的感染.     

结核感染的固有免疫识别

肺结核是结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的重大传染病.固有免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞等在宿主抵抗MTB入侵过程中发挥了重要作用,多种模式识别受体参与了MTB的识别.本文从固有免疫细胞及其免疫识别受体两个方面综述了结核感染的识别过程,着重探讨了Toll样受体、C型凝集素受体和NOD样受体在MTB识别中的作用机制.     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

活性污泥合成PHA及其对磁场的响应研究

在好氧瞬时供料工艺下,采用逐步增加负荷法对活性污泥进行驯化,控制每个周期丰盛一匮乏时间比为1：3．当有机负荷为5420mgCOD·L^-1时,PHA（polyhydroxyalkanoate）含量可达48．6％;当有机负荷为720mgCOD·L^-1时,PHA的合成速率最高达到0．18mgCOD／mg CODX·h,取驯化好的污泥在不同磁场强度下进行PHA的合成,实验发现磁场对聚羟基丁酸（hydroxybutyrate,HB）和聚羟基戊酸（hydroxyvalerate,HV）的合成产生影响．磁场强度为7mT时,活性污泥中HB含量最高;在磁场强度为21mT时,活性污泥中HV含量最高;在磁场强度为11mT时,活性污泥中PHA含量最高．强度为7mT的磁场对HB聚合酶活性促进作用最大;强度为21mT的磁场对HV聚合酶活性促进作用最大．     

人γ干扰素 /β 肿瘤坏死因子融合蛋白 His6融合表达及一步纯化

将人 V干扰素 /U肿瘤坏死因子融合蛋白 (hVTNF-U )重组基因克隆于表达载体 pET28,构建成 T7 lac启动子控制下的 His6融合表达质粒 ,转化溶源菌 E. coli BL21( DE3).经 IPTG(1mM )诱导表达 , 阳性菌在 SDS-PAGE泳图上出现一条粗表达带 ,其分子量 (32kDa) 与目的蛋白 H is6-V TN F-U ) 理论分 子量相符. 薄层扫描与溶解性分析显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 45% 以上 ,主要为不溶性的包涵体 ( IBs).离心分离 IBs产物 ,溶于 7M尿素中 ,然后通过 Ni柱进行亲和层析 ,即可获得一步纯化的表达产物 (纯度为 96%、回收率为 91% ).纯化产物再经复性缓冲液稀释复性 ,其细胞毒比活性与抗病毒比活性分 别达到 1. 2× 10 7～ 2. 0× 107u /mgp和 6. 6× 10 5 ～ 7. 2× 105 u/mgp.     

猪瘟病毒野强毒株持续感染细胞模型的初步研究

经过筛选和连续传代，建立了稳定的猪瘟病毒野强毒株(csFv22)感染猪肾传代细胞系(PK—15)的持续感染细胞模型，获得csFV22—PK15病毒持续感染的传代细胞株．用免疫荧光技术、RT—PcR技术、透射电镜、流式细胞仪研究了csFV22—PK15细胞株连续传代中病毒在细胞内持续感染的基本特性．结果显示传代细胞表现为病毒持续感染的基本特征．     

1,10-邻菲罗啉并咪唑类受体与阴离子作用研究

设计并合成了邻菲罗啉并咪唑类阴离子受体2-(4-溴苯酚基)-1H-咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉,对其进行了紫外-可见,X衍射单晶衍射表征.通过荧光滴定、理论计算和晶体结构分析,研究了受体对5种阴离子(F、Cl、Br、I、H2PO24、CH3COO)的传感作用及作用机理.结果表明受体对CH3COO、F、H2PO24有很强的传感作用,形成1:1的氢键超分子,对Cl的作用较弱,对Br、I没有明显传感作用.     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

3种多环芳烃和UV-B辐射对3种赤潮微藻生长的作用

通过实验生态学的方法，研究了3种多环芳烃（菲、芘和蒽）对3种赤潮微藻（赤潮异弯藻、亚历山大藻和中肋骨条藻）生长的影响．结果表明：低浓度的菲、芘和蒽处理对3种赤潮微藻的生长都有刺激作用，而高浓度处理则显示出抑制作用．菲、芘和蒽处理对赤潮异弯藻生长96hEC50分别为0．059、0．071、0．078mg／L，对中肋骨条藻的96hEC50分别为0．079、0．097、0．112mg／L，对亚历山大藻的96hEC50分别为0．089、0．107、0．119mg／L．在菲、芘和蒽处理的同时，附加辐射剂量为0．3J／m^2的UV—B辐射处理，3种多环芳烃对3种赤潮微藻的生长抑制作用更加明显．