荧光光谱和圆二色谱研究重组内皮抑素与芦荟大黄素的相互作用

利用荧光光谱法和圆二色谱法研究了重组内皮抑素与中药有效成分芦荟大黄素的相互作用机制,求得两者在25℃和37℃的结合常数Ka为6.623×104和3.796×104。研究发现,Zn2+等5种金属离子能够竞争性降低重组内皮抑制与芦荟大黄素的结合常数,下降幅度为35%～55%,并且其影响程度随温度升高而增强。鸡胚尿囊膜血管生成实验结果表明,芦荟大黄素能增强重组内皮抑素的抗血管生成活性,使其对新生血管的抑制作用提高50%。     

两步柱色谱法分离纯化重组肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5

建立了一种用Ni2+螯合的Chelating Sepharose Fast Flow亲和柱色谱和Sephadex G-75凝胶排阻柱色谱分离纯化重组肿瘤血管生长抑制因子Kringle 5的方法。采用该工艺得到的重组Kringle 5经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明其纯度约为98%,且具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成的生物活性。     

基因重组可溶性非融合血管生成抑制剂Kringle 5的色谱分离和纯化

Kringle 5是血纤维蛋白溶酶原中特异抑制内皮细胞增生和迁移活性最高的一种血管生成抑制剂。该实验在前期成功克隆和表达可溶性非融合血管生成抑制剂Kringle 5的基础上,建立了一种两步色谱法分离纯化Kringle 5的方法。首先用SP Sepharose Fast Flow强阳离子交换色谱柱对Kringle 5重组菌体破碎上清液进行初步分离,然后再用丙烯葡聚糖凝胶S-100 HR凝胶排阻色谱柱对其进行进一步的纯化。采用本方法得到的可溶性非融合血管生成抑制剂Kringle 5经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效凝胶排阻色谱检测其纯度大于98%,通过鸡胚尿囊膜法确定这种蛋白质具有抑制内皮毛细血管生长的活性。     

重组内皮抑素的质谱分析及对内皮细胞周期的影响

采用质谱、圆二色谱、荧光光谱与细胞周期分析技术研究了重组内皮抑素的蛋白结构和对内皮细胞的作用机制.研究发现,以包涵体方式表达的蛋白中会有未被降解的N末端甲硫氨酸产物,重组内皮抑素在G₂期阻断内皮细胞的生长.表明内皮抑素引发内皮细胞凋亡与细胞周期相关,为抗血管生成治疗肿瘤研究奠定了实验基础.     

鲨鱼软骨血管形成抑制因子的分离纯化及其活性的初步研究

以广东阳江鲨鱼软骨为原料,研究了鲨鱼软骨新生血管形成抑制因子的分离纯化方法,并对其生物学活性进行了初步研究.采用盐酸胍抽提、膜超滤、丙酮分级沉淀、SephadexG-75柱层析和C₄反相高效液相色谱等步骤,分离纯化出一种新的鲨鱼软骨血管生成抑制因子-a(SharkCartilageAngiogenesisInhibitor-a,SCAI-a),分子量为12600,能显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管的形成.     

MALDI-TOF-MS法对重组人内皮抑素蛋白分子质量测定

肿瘤的生长依赖于血管的生成,新生血管不仅为肿瘤生长提供必需的营养物质,而且为肿瘤细胞扩散提供了重要的途径。1997年哈佛大学的O'Reilly等发现了一种内源性新血管生成抑制因子内皮抑素(Endoscatin),显示出特异抑制激活的血管内皮细胞增殖和肿瘤新血管生成的生物学活性,其抗肿瘤作用具有高效、低毒、无耐药性的优点。目前,内皮抑素的研究引起了国内外广泛的兴趣,在美国已进行以安全性为目的的I期临床实验,国内也有多家公司对内皮抑素进行了抗肿瘤研究并申报一类新药。内皮抑素有望成为医治肿瘤而又没有化疗和放疗的毒副作用的一种新的治疗方法,但是否能作为药物应用于临床,尚需对内皮抑素的结构特点及抑制肿瘤和内皮细胞的作用机制等方面进行许多深入的研究。     

地鳖纤溶活性蛋白(EFP)的分离纯化、红外光谱分析及抑制鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成研究

以传统中药材地鳖为原料, 采用匀浆、盐析、硫酸铵分段沉淀、透析和DEAE-52纤维素离子层析等纯化方法, 从其体内分离纯化得到一种纤溶活性蛋白(Fibrinolyric protein of Eupolyphaga sinensis Walker, EFP), 采用SDS-PAGE电泳法对该蛋白进行了分子量和纯度测定, 结果表明, 从地鳖中提取纯化的EFP为相对分子量为41300的单一成分, 具有明显的纤溶活性, 由蛋白质和糖的红外光谱特征吸收峰可推断EFP为一种糖蛋白. EFP对鸡胚尿囊膜新生血管生成有良好的抑制作用, 比阳性对照组(地塞米松组)对鸡胚生长发育影响要小. 地鳖虫纤溶活性蛋白组分具有抑制血管生成的作用, 有可能用于肿瘤治疗.     

稀土离子对重组内皮抑素与肝素相互作用的影响

通过荧光光谱法和圆二色谱法研究了重组内皮抑素与稀土离子和肝素的作用.结果表明,稀土离子和肝素都可以与重组内皮抑素结合并引起蛋白的荧光猝灭和二级结构的改变,稀土离子与重组内皮抑素的结合会影响其与肝素的相互作用,并降低重组内皮抑素对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制活性.     

17400鲨鱼软骨血管生成抑制因子的纯化及生物学活性研究

采用盐酸胍抽提、膜超滤、丙酮分级沉淀、Sephadex-75柱层析和C₄反相高效液相色谱等分离步骤,从广东阳江鲨鱼软骨中纯化获得新的鲨鱼软骨血管生成抑制因子SCAI-c(SharkCartilageAngiogenesis In-hibitor-c,SCAI-c);SDS-PAGE电泳银染显示为一条带,根据蛋白质的相对迁移率计算,分子量为17400;它对鸡胚绒毛尿囊膜血管的形成具有显著抑制效应,并有明显的浓度依赖关系.SCAI-c与SCAI-a具有类似的生物学特征.     

5-氨基-1,3-二氢-1,3-二氧-异吲哚-2-丙酸类衍生物的合成及抗血管生成活性研究

根据RGD序列肽的构效关系, 设计并合成了一系列以5-氨基-1,3-二氢-1,3-二氧-异吲哚-2-丙酸为分子骨架的新化合物. 其中间体和目标物的化学结构经¹H NMR, MS和元素分析确证. 体外初步生物活性筛选结果表明, 目标物在10^－5 mol/L浓度下对bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成有显著抑制活性.     

Purification and characterization of recombinant murine endostatin in E. coli

Endostatin, a carboxyl-terminal fragment of collagen XVIII is known as an anti-angiogenic agent, that specifically inhibits the proliferation of endothelial cell and the growth of several primary tumor. We report here the purification and characterization of the recombinant murine endostatin (rmEndostatin) which was expressed in a prokaryotic expression system. This rmEndostatin has similar physiochemical properties of yeast-produced recombinant endostatin, and it also specifically inhibits the proliferation and migration of bovine capillary endothelial cells stimulated by basic fibroblast growth factor. The biological activity of rmEndostatin was also shown by its anti-angiogenic ability on the chorioallantoic membrane of chick embryo in vivo. In this article, we demonstrate the refolding and purification of rmEndostatin, expressed using E. coli system, to a biologically active and soluble form. In addition, these results confirm the activity of endostatin as a potent anti-angiogenic agent.     

Cloning,Expression, Purification and Refolding of Microtubule Affinity-Regulating Kinase 4 Expressed in Escherichia coli

Microtubule-associated protein/microtubule affinity-regulating kinase 4 (MARK4) is a member of the family Ser/Thr kinase and involved in numerous biological functions including microtubule bundle formation, nervous system development, positive regulation of programmed cell death, cell cycle control, cell polarity determination, cell shape alterations, cell division etc. For various biophysical and structural studies, we need this protein in adequate quantity. In this paper, we report a novel cloning strategy for MARK4. We have cloned MARK4 catalytic domain including 59 N-terminal extra residues with unknown function and catalytic domain alone in PQE30 vector. The recombinant MARK4 was expressed in the inclusion bodies in M15 cells. The inclusion bodies were solubilized effectively with 1.5 % N-lauroylsarcosine in alkaline buffer and subsequently purified using Ni–NTA affinity chromatography in a single step with high purity and good concentration. Purity of protein was checked on sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis and identified by using mass spectrometry immunoblotting. Refolding of the recombinant protein was validated by ATPase assay. Our purification procedure is quick, simple and produces adequate quantity of proteins with high purity in a limited step.     

18O同位素标记定量肽段串联体蛋白质结合同位素稀释-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法

建立了定量肽段串联体蛋白质(concatamers of Q peptides, QconCATs)结合¹⁸O同位素标记-多反应监测质谱的蛋白质绝对定量新方法。首先对QconCAT重组蛋白质进行了纯度表征,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征结果表明重组蛋白质的纯度在99%以上,相对分子质量约为63.4 kDa。对QconCAT重组蛋白质酶切后的肽段混合物进行质谱分析,并经pFind和pLabel软件处理,验证了目标肽段。还考察了QconCAT重组蛋白质的酶切效率和¹⁸O标记效率,并对QconCAT蛋白质结合¹⁸O标记-同位素稀释-多反应监测质谱方法进行了评价。实验结果表明,采用该方法对腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis, TTE)中选定蛋白质的肽段进行绝对含量测定时,相对标准偏差小于20%,准确度较高,说明该方法可用于复杂生物样本中蛋白质的绝对定量。更重要的是所建方法不仅解决了细胞培养氨基酸稳定同位素标记(SILAC)技术的重标试剂价格昂贵的问题,也为定量蛋白质组学提供了一种新的方法。     

来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因的合成与融合表达

将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换, 利用化学和基于聚合酶链反应(PCR)技术的酶促方法进行基因全合成, 利用pET-32a构建重组表达载体pET-dan, 转化进E.coil BL21(DE3)中进行融合表达. 经SDS-PAGE电泳、 Western-blot检测和活性测定发现, D-ANase可在大肠杆菌中高效表达, 目的蛋白可达到菌体总蛋白的69.2%, 密码子优化后基因构建的工程菌发酵活性为96 U/mL, 重组蛋白经超声细胞破碎及Ni²⁺柱亲和层析纯化, 比活可达1692.3 U/mg, 纯度可达95%以上.     

新型抗HIV-1蛋白GRFT的构建、表达及活性研究

根据已知的新型抗HIV-1蛋白GRFT基因氨基酸序列,推测其DNA编码序列,密码子优化及修饰后进行全基因化学合成,连接到原核表达载体pET28a（+）中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,获得目的蛋白. SDS-PAGE、Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达并具有抗原活性;对表达条件进行优化,在最佳表达条件下,目的蛋白的表达量可占菌体总蛋白的55.84%;利用Ni2+-NTA柱亲和层析法进行目的蛋白的复性和纯化,凝胶成像系统扫描分析表明,纯度可达94.06%;运用Dot-ELISA法进行复性蛋白的抗原结合活性检测,结果显示,目的蛋白能够与HIV-1膜蛋白抗原特异性结合,初步证明所表达的重组蛋白具有良好的体外结合活性;基于制备的能够表达HIV-1 gp120基因的靶细胞模型,运用IFA法开展目的蛋白的细胞结合活性研究,结果显示,目的蛋白能够与靶细胞发生特异性反应,表明成功制备并获得了具有生物活性的新型抗HIV-1蛋白GRFT,为进一步研制新型抗HIV-1基因工程药物及其靶向治疗制剂奠定了坚实基础.     

反相高效液相色谱法分离重组促红细胞生成素

利用反相高效液相色谱法对重组促红细胞生成素进行了纯化。结果表明,利用Ｃ４反相柱和乙腈－三氟乙酸流动相在洗脱梯度和上样样品纯度等条件都较适当时,可以简单、快速、高效地从粗品中分离出重组促红细胞生成素,获得的产品纯度高,接近１００％;比活性好,约为１．９６×１０８ＩＵ／ｇ蛋白。     

Purification of a recombinantly produced transmembrane protein (gp41) of HIV I

The transmembrane protein gp41, a component of the viral envelope of HIV I, and its analogue gp36 of HIV II are important antigens for the sensitive and specific detection of anti-HIV antibodies. The immunodominant region of the protein gp41, which reacts with 100% of sera of infected persons, was produced by gene technological means in Escherichia coli. The protein accumulates in the form of insoluble inclusion bodies in the bacterial cell. Purification strategies for this aggregated material depend mainly on the isolation of these "inclusion bodies" and subsequent washing procedures. Growth conditions of the recombinant E. coli cells and the method of the cell disruption are important for the efficiency of purification and the recovery of the antigen. Owing to the insolubility of the expressed antigen, a significant concentration of recombinant gp41 was possible by extracting the soluble cell components. For this purpose, mild detergent solutions and low-molarity chaotropic buffer solutions were used. After final solubilization in 8 M urea buffer at pH 12.5, further chromatographic purification steps followed. The reduction of disulphide bridges with beta-mercaptoethanol or dithiothreitol was important. Gel filtration on a Sephacryl S-200 or Superose 12 column and/or ion-exchange chromatography on a DEAE-Sepharose Fast Flow or Mono Q HR (5/5) column finally resulted in the desired purity of the antigen.