镧、钆、镱三种稀土离子诱导背根神经元凋亡及膜上钾电流的比较研究

运用流式细胞仪和膜片钳技术研究La3+,Gd3+,Yb3+三种稀土离子诱导大鼠背根神经元DRG凋亡以及膜上钾离子通道的影响。结果表明:10,100,1000μmol.L-1LaCl3和GdCl3处理DRG神经元96 h,细胞不出现凋亡;YbCl3处理96 h,细胞的凋亡率明显递增。胞外La3+,Gd3+,Yb3+抑制瞬间外向钾电流IA,使IA的激活和失活过程都显著右移,抑制和右移的程度La3+最弱,Gd3+次之,Yb3+最强;胞内的La3+,Gd3+,Yb3+抑制延迟整流钾电流IK,抑制的程度也呈增长趋势。稀土离子在胞内外的结合位点不同;Yb3+较La3+和Gd3+的神经毒性强。     

多壁碳纳米管诱导A549细胞氧化应激与去极化线粒体膜电位

以人肺上皮细胞系A549为模型细胞, 探讨多壁碳纳米管的细胞毒性效应及其机制. A549细胞暴露于不同浓度(0~300 μg/mL)的多壁碳纳米管后, 用MTT比色法检测细胞活力和Hoechst 33342染色法观察细胞形态; 用活性氧(ROS)敏感探针2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)结合流式细胞仪检测细胞内ROS水平; 用荧光探针JC-1结合激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位ΔΨm的变化; 用免疫荧光和蛋白印迹法检测细胞氧化应激敏感蛋白血红素氧合酶-1(HO-1)的表达水平. 结果表明, 多壁碳纳米管可引起A549细胞活性降低、细胞内活性氧ROS过量产生以及谷胱甘肽GSH含量下降, 诱导细胞氧化应激效应; 抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)抑制多壁碳纳米管诱导的A549细胞内ROS的产生. 多壁碳纳米管处理A549细胞2 h后, 诱发细胞线粒体膜电位下降; 多壁碳纳米管诱导细胞氧化应激的同时伴有适应性应激蛋白HO-1的上调表达. 结果表明, 细胞氧化应激和线粒体膜电位去极化可能是多壁碳纳米管诱导A549细胞毒性效应的重要机制.     

芯片毛细管电泳评估脂质体介导超氧化物歧化酶减低细胞内氧化应激

超氧化物歧化酶(SOD)可用作抗氧化的药物。它能催化并清除细胞内的活性氧组分(ROS),保护细胞免受自由基的氧化破坏。但是由于SOD分子量较大,难以透过细胞膜进入细胞内,显著降低了SOD的药效。本研究用激光共聚焦荧光显微镜拍摄的荧光图像说明,纳米脂质体可介导SOD进入细胞。用芯片毛细管电泳激光诱导荧光分析法(MCE-LIF)测定单细胞中ROS和谷胱甘肽(GSH)的荧光信号强度,评估了用脂质体包裹的SOD与细胞作用的抗氧化效果。用脂质体包裹的SOD与肝癌细胞共培养2h,与直接用SOD作用于肝癌细胞相比较,细胞内ROS明显降低,GSH明显提高。实验结果说明,用脂质体包裹SOD是一种减低细胞内氧化应激的有效给药途径。     

氯化钆对糖尿病小鼠模型的降糖作用

在离体培养人胰腺前体细胞时在培养基中加入GdCl3,观察发现GdCl3能够使人胰腺前体细胞聚集,在诱导因子共同存在下,进一步诱导人胰腺前体细胞成为胰岛样结构。用STZ诱导小鼠构建I型糖尿病小鼠模型。当每4 d给I型糖尿病小鼠腹腔注射GdCl3溶液,25 d后观察到小鼠的空腹血糖值明显降低,IPGTT试验结果显示,小鼠糖代谢得到明显改善。结果表明,可能的机制为：GdCl3通过促进胰腺干细胞分化成为成熟的胰岛素分泌细胞,增加内分泌细胞的数量,从而促进受损胰腺的再生与修复,起到降低糖尿病小鼠血糖水平的作用。     

亚硒酸钠通过活性氧(ROS)/谷胱甘肽(GSH)/谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)轴诱导非小细胞肺癌A549细胞铁死亡

硒作为人体必需的微量元素,具有抗癌作用,但其抗癌机制尚不明确,因此,通过探讨亚硒酸钠是否可以通过铁死亡途径抑制肺癌A549细胞增殖及其肺癌A549细胞发生铁死亡的具体机制。通过细胞增殖实验(CCK-8实验)及细胞计数实验评价亚硒酸钠对A549细胞增殖的影响,通过流式细胞术分析亚硒酸钠对肺癌A549细胞内线粒体膜电位(MMP)及活性氧(ROS)水平的影响,通过亚铁离子检测试剂盒检测亚硒酸钠作用后肺癌A549细胞内亚铁离子含量变化,MDA检测试剂盒分析亚硒酸钠作用后肺癌A549细胞内脂质氧化产物丙二醛(MDA)含量,分光光度法分析亚硒酸钠对肺癌A549细胞内谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)及谷胱甘肽(GSH)的表达影响。研究发现：亚硒酸钠能够显著抑制肺癌A549细胞增殖,且亚硒酸钠抑制肺癌A549细胞的半数抑制率(IC₅₀)为10μmol/L;亚硒酸钠能诱导肺癌A549细胞内ROS过度积累并使细胞内谷胱甘肽耗竭;亚硒酸钠作用后,细胞内线粒体膜电位水平显著降低,MDA含量升高而GPX4蛋白表达下调。研究表明,亚硒酸钠能通过诱导肺癌A549细胞内ROS过度积累,引起细胞内...     

SERS纳米探针对电刺激过程中细胞内产生活性氧的检测

电刺激是用于细胞内紊乱电活动引起疾病的一类重要治疗方式. 在电刺激过程中是否会诱导细胞内活性氧(ROS)水平的改变, 以及常规抗氧化抑制药物与电刺激治疗同时运用带来的影响, 目前尚未有相关研究. 本文设计了一种具有较好生物相容性的金/银核壳纳米棒表面增强拉曼(SERS)活性探针, 用于电刺激过程中细胞内产生ROS的检测. 将该探针与细胞共孵育, 使其内化入细胞, 对细胞进行不同时间的电刺激, 利用拉曼光谱对SERS探针的信号进行检测. 实验结果表明, 随着电刺激时间的延长, SERS信号减弱, 说明细胞内产生ROS的量明显增加. 该传感机制是利用ROS能刻蚀金/银核壳纳米棒的银壳, 从而使其变薄引起SERS信号减弱. 抗坏血酸(AA)和谷胱甘肽(GSH)两种抗氧化抑制剂类药物与电刺激同时运用时, 可观察到它们会对电刺激过程产生的ROS有清除作用. 该研究发展了一类用于细胞内ROS检测的光谱方法, 也为异常的氧化应激和肿瘤治疗过程中的组合用药提供了建议.     

具有选择性抗癌活性的含硒配位组装体:活性氧物种的调控

活性氧物种(ROS)由于其在生物体内的"双刃剑"作用受到越来越多的关注.ROS在低浓度下能够促进细胞生长,而在高浓度下会诱导细胞凋亡.硒作为人体必需的微量元素之一,具有调控细胞内ROS浓度的作用.通过研究具有不同结构的含硒两亲性分子与顺铂、二氯化铂的配位情况,探讨硒与铂之间的配位作用;并进一步研究配位组装体在细胞内调控ROS的能力,探讨选择性抗癌活性的产生机制.结果表明,含硒分子能够与铂类化合物进行配位,生成具有选择性抗癌活性的组装体;该抗癌活性源于组装体对细胞内ROS浓度的调控.期望能够拓展含硒配位组装体在抗癌领域的应用,为选择性抗癌药物的开发提供新的思路.     

HPLC测定砷对星形胶质细胞内GSH含量的影响

建立高效液相色谱法(HPLC)检测星形胶质细胞(AC)内谷胱甘肽(GSH)含量的测定方法,探讨急性砷暴露对AC内GSH水平的影响,为砷对神经系统损伤机制研究提供检测手段.结果表明,该方法准确、灵敏、可靠.AC内GSH含量随急性砷暴露剂量增加而逐渐升高.     

多溴二苯醚对体外培养海马神经元生长的影响

多溴二苯醚(PBDE)是一种普遍存在的持久性环境污染物, 对其毒效应的研究工作已引起广泛关注. 然而, PBDE神经毒性的研究工作仍处于起步阶段, 相关报道不多. 以原代培养的大鼠海马神经元暴露于商品用的十溴代PBDE(deca-BDE), 借助激光共聚焦显微镜采图, 考察了PBDE对神经元生长发育的影响. 15 μmol/L deca-BDE暴露明显抑制了神经元突起的生长, 包括突起长度和分叉均显著性地降低, 神经元突触的形成和发育成熟也受到了明显的抑制. 以上结果有力证明了PBDE对体外培养神经元具有明显的神经毒作用.     

纳米材料诱导内质网应激途径的研究进展

随着纳米技术的蓬勃发展,纳米材料已被广泛用于化妆品、医药卫生、国防科技等领域.由于纳米材料的特殊物理化学性质,在其生产、加工、运输以及应用的过程中增加了人类的暴露风险及潜在的健康危害.研究显示,纳米材料能够在动物、细胞、分子及基因水平对生物体造成毒性损害,而活性氧的生成和氧化应激的产生则是这种毒性损害的重要机制.内质网作为细胞内蛋白质合成、加工及储存Ca~(2+)的重要场所,对细胞内稳态的变化十分敏感,细胞的氧化应激损伤及细胞内Ca~(2+)平衡的紊乱都会诱发内质网应激,继而通过内质网应激途径导致细胞凋亡.本文对纳米材料与内质网应激及相关细胞功能的影响进行了综述.     

Gd3+/Yb3+掺杂ZnO量子点作为双模式磁共振/CT成像探针

基于结合磁共振成像(MRI)的高空间分辨率和CT成像的深穿透能力设计思想,在乙醇溶液中水解醋酸锌、醋酸钆和醋酸镱,制备了油酸稳定的Gd3+/Yb3+掺杂ZnO量子点(ZnO∶Gd/Yb),并对其表面进行了氨基修饰。研究了ZnO∶Gd/Yb量子点的弛豫性能、X射线吸收性能、细胞毒性及体外MRI和CT成像。当Zn2+,Gd3+,Yb3+的摩尔比为1.0∶0.12∶0.20时,ZnO∶Gd/Yb量子点展现了最高的弛豫效率6.06 mmol/(L.s)对X-射线的吸收能力也显著高于临床CT造影剂碘比醇。体外MRI和CT成像实验表明,当Gd3+的浓度为1.5 mmol/L时,T1加权MRI信号明显增强,当Yb3+的浓度为5 g/L时,可呈现清晰的CT图像。细胞毒性实验表明,ZnO∶Gd/Yb量子点的浓度低于1.5 mmol/L(Gd3+)时,量子点的毒性相对较低。     

Gd3+对原代培养的小鼠骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化的影响

本文采用MTT法、碱性磷酸酶活性测定、矿化功能的测定以及油红O的染色和定量测定等手段研究了Gd3+对原代培养的小鼠骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化的影响。研究结果表明,浓度为1×10-10和1×10-8 mol.L-1的Gd3+对小鼠骨髓基质细胞的增殖没有影响,其他测试浓度下的Gd3+则抑制小鼠骨髓基质细胞的增殖。当Gd3+与小鼠骨髓基质细胞作用7 d时,其对小鼠骨髓基质细胞成骨分化的影响与作用浓度有关,当Gd3+与小鼠骨髓基质细胞作用14 d时,在全部测试浓度范围内,抑制小鼠骨髓基质细胞成骨分化。除1×10-8和1×10-5 mol.L-1外,其他测试浓度下的Gd3+促进小鼠骨髓基质细胞的矿化功能。当Gd3+与小鼠骨髓基质细胞作用10 d时,其抑制小鼠骨髓基质细胞的成脂分化,当Gd3+与小鼠骨髓基质细胞作用16 d时,除1×10-9mol.L-1外,其他浓度的Gd3+也抑制小鼠骨髓基质细胞的成脂分化。实验结果提示,Gd3+可能通过促进骨髓基质细胞的成骨分化、抑制其成脂分化途径起到对骨的保护作用。Gd3+对原代培养的小鼠骨髓基质细胞成骨分化和成脂分化的影响与作用浓度和时间有关,而且,它们是影响Gd3+对骨是损伤还是保护作用转变的关键因素。     

卵磷脂抗石英毒作用的研究

本文采用家兔肺泡巨噬细胞(AM)体外培养法,以细胞内游离钙浓度([Ca~(2+)]_i)、细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)活性为指标,观察了卵磷脂、脑磷脂及现用防治硅肺药物克矽平(PVPNO)、柠檬酸铝等抗石英毒效果。结果表明:卵磷脂在所试各药物中效果最佳.初步探讨了卵磷脂拮抗石英细胞毒性的机理.卵磷脂有成为防治硅肺药物的可能性.     

大长径比金纳米棒的合成及其单细胞毒性研究

利用三步晶种生长法合成长径比约为14的大长径比金纳米棒(GNR),利用巯基十一酸(MUDA)对金纳米棒表面进行了生物适应性修饰,并在宏观水平上研究了修饰前后的金纳米棒在对细胞活性的影响。利用单细胞方法分别考察了修饰后的纳米金棒对细胞贴壁过程、增殖速率、细胞内ROS以及骨架排布的影响。虽然MTT细胞活性结果显示内吞后的金纳米棒对细胞无毒,但单细胞毒性分析方法发现,不同浓度纳米金棒对早期贴壁过程有较小的影响,且内吞的纳米金棒在一定程度上促进了细胞的增殖,而高浓度下纳米金棒引起了细胞内ROS含量的升高,并破坏了细胞内骨架纤维排布。本研究建立了用单细胞行为分析纳米颗粒对细胞毒性的方法,证明了以往仅仅利用MTT等宏观手段分析纳米材料生物适应性是不足的。纳米材料在生物医学领域的进一步应用还应考虑单细胞及分子水平上的毒性效应。     

缺氧预处理诱导心肌细胞蛋白质组变化的初步研究

缺氧预处理(hypoxia preconditioning, HPC)可模拟缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)对缺血/再灌注心肌的保护作用, 涉及细胞内众多分子事件. 本工作旨在采用双向电泳和质谱分析等蛋白质组分析技术, 发现缺氧预处理后心肌细胞蛋白质整体表达上的变化, 初步分析其与缺氧预处理心肌保护作用的关系. 将原代培养的SD乳鼠心肌细胞分为2组(n＝6): (1)缺氧预处理组(HPC): 将细胞置缺氧仓内短暂缺氧20 min进行缺氧预处理(HPC), 制备心肌细胞蛋白提取物; (2)对照组(control): 细胞置于培养箱内持续常氧孵育至实验结束, 提取蛋白. 采用双向凝胶电泳和图像扫描, 经蛋白样本分离和考马斯亮蓝染色后比较分析, 选取3个差异表达蛋白点进行胶内酶切、肽质量指纹图谱分析和数据库检索. 双向电泳可分离约529±45个蛋白质, 点匹配率约为78%±7.5%. 18种蛋白质在HPC后发生明显表达差异, 其中12种蛋白质表达降低, 6种表达增高. 经质谱分析鉴定出的3种蛋白质分别为myosin light polypeptide 3, nucleoside diphosphate kinase (NDPK)和calreticulin (CRT). 缺氧预处理引起心肌细胞蛋白质组变化, 初步发现其中myosin light polypeptide 3表达下调、nucleoside diphosphate kinase和calreticulin表达增加, 可能通过调节心肌细胞的收缩性、激活G蛋白、调节细胞内Ca^2＋浓度而保护心肌. 本工作通过研究缺氧预处理延迟保护过程中心肌内源性蛋白表达水平的变化, 有助于从细胞水平探讨预处理延迟保护机制.     

稀土离子(La3+, Gd3+, Yb3+)对线粒体产生活性氧的影响

研究了稀土离子对分离的线粒体产生活性氧(ROS)的影响. 采用荧光光度法跟踪线粒体内H2O2生成的动力学, 发现三种稀土离子(La3+, Gd3+, Yb3+)均能降低线粒体H2O2的生成; 用黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶体系进一步证明稀土对超氧阴离子(·O-2)存在清除作用, 而对H2O2无清除作用; 测定了稀土对线粒体ROS代谢酶(谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶)的活性影响. 结果表明, 三种稀土离子对线粒体谷胱甘肽过氧化物酶的活性基本没有影响, 而Gd3+和Yb3+稀土离子能明显抑制线粒体超氧化物歧化酶的活性.     

多壁碳纳米管活化A549细胞核转录子-κB的机制

探讨多壁碳纳米管对人肺上皮细胞A549核转录因子-κB(NF-κB)活性的影响及其活化机制.不同浓度的多壁碳纳米管作用于A549细胞后,用活性氧(ROS)敏感探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯结合流式细胞仪检测细胞内氧化应激状态;用凝胶电泳迁移率改变这一分析技术检测A549细胞NF-κB DNA结合活性;用蛋白印迹检测A549细胞NF-κB p65蛋白和IκBα蛋白表达;用免疫荧光结合共聚焦显微镜观察A549细胞NF-κB p65蛋白的核转位情况.结果表明,多壁碳纳米管诱导A549细胞内ROS过量产生和NF-κB DNA结合活性;同时伴有p65蛋白核移位和IκBα蛋白胞浆降解.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)可抑制多壁碳纳米管诱导的A549细胞内ROS产生、NF-κB DNA结合活性、p65蛋白核移位以及IκBα蛋白降解.结果表明,多壁碳纳米管可以通过诱导A549细胞氧化应激机制从而活化核转录因子NF-κB活性.     

不同草酸/钙摩尔比条件下草酸钙晶体的生长及对HK-2细胞的毒性

研究了不同草酸/钙(Ox/Ca)摩尔比对CaOx晶体在损伤前后的人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)表面的生长差异及形成的晶体对细胞的毒性差异. 实验结果表明, CaOx过饱和溶液对正常细胞和损伤细胞均会产生进一步的损伤, 导致细胞活力、 溶酶体的完整性和线粒体膜电位降低, 而细胞内活性氧(ROS)、 细胞骨架的紊乱程度、 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻比例和骨桥蛋白(OPN)表达量均增加; 且随着过饱和溶液中Ox/Ca摩尔比的增加而损伤加重. 正常细胞主要诱导二水草酸钙(COD)晶体形成, 且COD的含量与Ox/Ca摩尔比成正相关. 损伤细胞表面主要生成一水草酸钙(COM), 且晶体的数量和聚集程度与Ox/Ca摩尔比成正相关. 相比于正常细胞, 损伤细胞诱导的晶体棱角更加尖锐, 其对细胞的损伤大于棱角圆钝的晶体. 实验结果还表明, 降低CaOx的过饱和度、 减小Ox/Ca摩尔比和修复受损伤的肾上皮细胞均有利于抑制CaOx结石形成.     

柠檬酸钆配合物对宫颈癌细胞作用的蛋白质组学研究

为研究稀土化合物抗癌作用及其机制,本文采用差异蛋白质组学方法研究钆对宫颈癌细胞(HeLa)的作用,以四噻唑蓝比色法(MTT法)检测柠檬酸钆配合物([Gd(Cit)2]3-)对HeLa细胞生长的影响,并用Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡形态,利用双向凝胶电泳技术分离[Gd(Cit)2]3-作用HeLa细胞前后的蛋白,经图像分析后对蔗异点,进行MALDI-TOF-MS鉴定和数据检索.结果表明0.005～1 mmol·L-1浓度范围内的[Gd(Cit)2]3-对HeLa细胞生长的影响存在浓度依赖性.Hoechst 33258染色结果表明0.07 mmol·L-1[Gd(Cit)2]3-作用24 h对HeLa细胞的生长的抑制率为34%.质谱共鉴定出12个差异表达蛋白质点,包括延伸因子2、过氧化酶6、亲环蛋白A、烯醇酶1等在细胞中分别参与蛋白质转录与翻译、氧化应激、信号传导等过程的蛋白质.提示[Gd(Cit)2]3-可能通过调节胞内氧化应激水平,介导与调控信号转导与蛋白质表达等,从而诱导HeLa癌细胞凋亡.     

木香烃内酯诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡作用机制的研究

研究了木香烃内酯诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡的作用机制.采用流式细胞仪测定不同浓度木香烃内酯(0,2,4,8 μg/mL)作用于MCF-7细胞后细胞凋亡、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量及线粒体跨膜电位(Mitochondrial transmembrane potential,MTP)的变化,气相色谱-质谱联用(GC-TOF/MS)技术分析加药组与未加药组的代谢差异物.结果表明,木香烃内酯能诱导MCF-7细胞凋亡,并具有浓度依赖性,能够促使ROS含量升高;MTP在2μg/mL木香烃内酯作用时升高,在4和8μg/mL时显著下降;基于GC-TOF/MS的细胞代谢组学研究,最终发现15种代谢差异物.基于上述结果,推测木香烃内酯通过引起ROS含量升高、MTP降低,扰乱线粒体的正常功能,进一步阻碍TCA循环,抑制ATP合成,扰乱了细胞内代谢物的平衡,并引起位于膜间隙的凋亡相关蛋白释放,最终导致MCF-7细胞的凋亡.