新型水溶性花菁双嵌染料荧光测定蛋白质的研究

基于蛋白质对双嵌花菁染料具有良好的荧光增强作用,以新型水溶性碳菁染1,1’-丙磺酸-3,3,3’,3’-四甲基吲哚三次甲基碳菁-5,5’-二磺酸钾为荧光探针,建立了一种新的蛋白质荧光检测体系。实验考察了探针的荧光特征、浓度、缓冲体系pH、盐浓度和乙醇有机试剂等参数对体系荧光的影响。当pH2.0,花菁染料最大荧光激发波长为548 nm,发射波长为562 nm,血清蛋白与探针作用随着探针浓度的增加而加强,荧光增强值逐渐上升;当探针浓度为1.00×10-6mol·L-1时,牛血清蛋白BSA和人血清蛋白HSA对花菁探针荧光增强作用最为明显,体系荧光强度与蛋白质浓度成良好的线性关系,BSA和HSA线性响应浓度范围分别为0.20～15.00μg·mL-1和0.20～12.00μg·mL-1, 检测限(3σ/K)为0.01μg·mL-1。测定了血清蛋白BSA的合成样品,当BSA浓度为4.00,6.00,8.00μg·mL-1时,回收率为94.5%～103.3%。     

新的光散射体系测定蛋白质的研究

以1,6-己二胺二吖啶为荧光探针,建立了一种新的蛋白质共振散射检测体系。实验考察了该吖啶荧光探针的共振散射特征光谱、散射反应稳定性,研究了缓冲介质pH、探针浓度等参数对测定蛋白质的影响。结果表明,当pH 8.9时,1,6-己二胺二吖啶染料的散射波长为470 nm;加入BSA,反应约9 min后,体系光散射强度达到最大并维持稳定,2 h内无明显变化。当1,6-己二胺二吖啶探针(浓度1.00×10-4mol·L-1)用量为3.00 mL时,蛋白质与1,6-己二胺二吖啶的光散射增强作用显著,共振散射强度随着BSA的增加而明显增强,光散射强度与蛋白质浓度成良好线性关系,线性浓度范围为1.00～5.00 μg·mL-1,检测限(3σ/K)为0.085 μg·mL-1。测定了血清样品,浓度为2.00～4.00 μg·mL-1,回收率为98.0%～101.7%,测定偏差小于1.7％。     

探针3-(2-氰基乙基)胞嘧啶同步荧光法测定血清中蛋白质

在模拟人体生理条件下,基于3-(2-氰基乙基)胞嘧啶(CECT)与人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)之间的相互作用,以CECT为分子光谱探针研究了CECT-蛋白质体系的同步荧光光谱特征。同步荧光光谱特征及强度与Δλ值、反应介质、反应温度等因素有关。在此基础上,建立了以CECT为分子光谱探针定量测定血清样品中蛋白质含量的新方法。在最佳实验条件下,CECT-HSA和CECT-BSA体系的同步荧光强度分别在0～441.4和0～351.0 μg·mL-1的浓度范围内与蛋白质浓度呈现良好的线性关系, 检测限分别为0.023和0.035 μg·mL-1,相对标准偏差(RSD)1.2%～3.3%, 加标回收率为97.2%～100.4%。该方法具有简单、快速、灵敏度较高、线性范围宽、精密度和回收率较好等优点。该法可直接用于血清样品中蛋白质总量的测定,结果令人满意。     

探针5-氨基水杨酸锌测定蛋白质的应用研究

在模拟人体生理条件下,基于5-氨基水杨酸锌(5-ASZ)与血清白蛋白相互作用生成复合物,导致血清白蛋白的内源荧光产生特异性变化,从而建立了以5-ASZ为荧光探针,用固定波长同步荧光光谱分析测定蛋白质(HSA)的新方法。同步荧光光谱特征及强度与Δλ值、反应介质、反应温度等因素有关。在最佳实验条件下,体系的同步荧光强度(I_SF)与人血清白蛋白在1.66～496.8 μg·mL-1 范围内呈良好的线性关系,检测限为0.88 μg·mL-1(n=11)。在此基础上对血清、尿样和唾液中的蛋白质进行了测定,加标回收率在98.0 %～103.8%之间。实验结果表明：该方法具有简单、快速、灵敏度较高、线性范围宽、精密度和回收率较好等优点。该法直接用于样品中蛋白质总量的测定,获得了令人满意的结果,有望用于生化分析和临床分析领域。     

光谱法研究钙红-Cu(Ⅱ)络合物与蛋白质的相互作用及其应用

研究了钙红-Cu(Ⅱ)络合物与牛血清蛋白(BSA)作用的共振光散射光谱(RLS)、荧光光谱和电子吸收光谱特征,建立了利用金属配合物作为探针测定痕量蛋白质的方法。钙红-Cu(Ⅱ)-BSA三元络合物的形成导致RLS强度和荧光强度的增大;同时引起电子吸收光谱的强度减小,594 nm处吸收峰消失。在pH5.65～5.75的酸度条件下,钙红-Cu(Ⅱ)络合物与BSA系统在317 nm处有一增强的RLS光谱峰,且增强的RLS强度与BSA的浓度呈线性关系。在实验室确定的优化条件下,RLS强度与BSA浓度的线性范围为0.75～10 μg·mL-1, 线性方程为I=150.88+201.48c(BSA ,μg·mL-1),相关系数r=0.997 3。方法检出限为5.62×10-2 μg·mL-1。该方法成功地用于人工混合样品中BSA含量的测定。对钙红-Cu(Ⅱ)络合物与BSA的作用机制的研究表明,钙红-Cu(Ⅱ)络合物与BSA之间主要存在的是静电引力。     

同步荧光法测定生物样品中蛋白含量的研究

基于5-甲基尿苷(5-Methyluridine)与血清白蛋白(HSA)相互作用,导致血清白蛋白的同步荧光发生特异性变化,且体系的同步荧光强度和溶液中HSA的浓度呈良好的线性关系,建立了以5-甲基尿苷为分子探针,运用固定波长同步荧光光谱法测定生物样品中蛋白质总含量的新方法。文章考察了Δλ值、反应介质、试剂用量、离子浓度、试剂加入顺序、反应时间、反应温度等因素对体系同步荧光的影响。在选定的最佳实验条件下,体系的同步荧光强度与血清白蛋白在1.38～575.2 μg·mL-1范围内的线性相关系数为0.998 1,方法的检测限可达0.12 μg·mL-1。运用本方法对人血清、唾液和尿液等生物样品进行测定并进行加标回收实验,回收率在98.7%～103.8%之间。对11份5-甲基尿苷空白溶液进行平行测定,其相对标准差为1.56%。还考察了一些常见离子和有机物存在时对蛋白质测定的影响。结果显示,本方法具有简单、快速、灵敏度较高、线性范围宽、体系稳定、精密度高、重现性好等优点。该法可直接用于血清、唾液和尿样等生物样品中蛋白质总量的快速测定,结果令人满意。     

Meso-四(3,5-二溴-4-羟基苯基)卟啉褪色光度法测定蛋白质的研究与应用

采用吸光光度法研究了meso-四(3,5-二溴-4-羟基苯基)卟啉[T(DBHP)P]作为新型光谱探针与蛋白质相互作用的光谱行为。发现在pH 4.17 Britton-Robinson缓冲液中,吐温-80(Tween-80)微乳液介质可以显著增强了体系的灵敏度。在最佳实验条件下,考察了T(DBHP)P-蛋白质体系的吸收光谱特性,于425 nm处蛋白质的浓度在一定范围内与吸光度A呈良好的线性关系。分别用于测定牛血清白蛋白(BSA)和卵血清白蛋白(Ova),线性范围分别为0.50～6.00 μg·mL-1和0.05～0.60 μg·mL-1,检出限分别为0.11和0.039 μg·mL-1。实验结果表明,该方法具有较高的灵敏度、选择性和稳定性,成功地用于牛奶样品中蛋白质的测定,回收率为99.56%～100.2%,相对标准偏差低于2.2%。从而建立了一种测定蛋白质的灵敏方法并用于食品分析领域中。另外考察了离子强度及温度对体系的影响。     

头孢呋辛酯与牛血清白蛋白相互作用特征研究

采用荧光光谱、三维荧光光谱、同步荧光光谱和紫外吸收光谱法,研究了不同温度下头孢呋辛酯（CFA）的浓度在1.959×10-6至13.71×10-6 mol·L-1范围内,牛血清白蛋白(BSA)的浓度为2.0×10-6 mol·L-1时两者之间的相互作用,按照Sterm-Volmer方程、Lineweaver-Burk方程和热力学方程分析和处理实验数据,计算了表观作用常数（K_LB: 3.907×106 L·mol-1）,热力学参数的平均值（焓变ΔH：-13.43 kJ·mol-1,熵变ΔS：81.90 J·K-1和标准吉布斯自由能变化ΔGθ：-38.34 kJ·mol-1）,测定了作用位点数（n: 1.042）,讨论了CFA对BSA的荧光猝灭作用机理。BSA和CFA作用可能形成了一种新的复合物,猝灭作用主要属于静态猝灭。认可热力学参数ΔH≈0, ΔS＞0和ΔGθ＜0,反应力主要是熵驱动力和静电作用力。在同步荧光光谱中色氨酸和酪氨酸的峰波长明显红移;在三维荧光光谱中,在加入CFA后二峰的发射波长蓝移;在紫外-可见吸收光谱图中,三体系的最大吸收明显不同,这些均显现色氨酸和酪氨酸所处的微环境的变化,同时说明了加入CFA后BSA的构象发生了变化。这为讨论BSA的构象变化,阐明CFA的药理作用和在生物体内的生物学效应等提供重要信息。     

邻羟基苯基荧光酮荧光光度法测定牛血清白蛋白

研究了邻羟基苯基荧光酮(o-HPF)荧光光度法测定牛血清白蛋白(BSA)的反应条件,在pH 7.90的B-R缓冲溶液中,邻羟基苯基荧光酮(o-HPF)与BSA作用形成稳定的结合物,导致体系荧光猝灭,依据其荧光猝灭程度与外加BSA量的关系而建立定量测定BSA的方法。该方法具有良好的选择性和稳定性,由于采用二元体系,实验操作简单,干扰少,灵敏度较高,测定BSA线性范围为0.028～13.65 μg·mL-1,方法测定BSA回归方程为ΔF= 431.51c(10－7 mol·L-1)+457.78,相关系数r=0.997。测定方法中重金属离子如Pb(Ⅱ)等对BSA测定允许量较低,其余物质的存在对BSA的测定干扰较小。通过对o-HPF与BSA作用荧光猝灭常数的测定及热力学常数计算,讨论了o-HPF与BSA的作用机理,表明o-HPF与BSA作用方式主要为静电引力的非共价作用力, BSA对o-HPF荧光猝灭为分子间形成了结合物而引起的静态猝灭。     

测定双嘧达莫的化学发光新方法

提出了双嘧达莫与高锰酸钾和罗丹明B的化学发光新体系,并发现表面活性剂吐温-80可显著增强该体系的化学发光,据此建立了流动注射化学发光测定双嘧达莫的新方法。该方法选择性好,灵敏度高,线性范围宽,双嘧达莫在5.0×10-8～5.0×10-5g·mL-1范围内与发光信号呈线性关系,检出限1.7×10-8g·mL-1, RSD为1.1%(n=11, c_s=1.0×10-6g·mL-1双嘧达莫浓度)。     

卟啉全内反射同步荧光法测定蛋白质

应用全内反射与同步荧光相结合的技术,建立了利用蛋白质吸附在液-固界面上的同步荧光信号来测定本体蛋白质溶液浓度的新方法。其原理为meso-四(4-磺酸基苯基)卟啉(TPPS)标记牛血清蛋白(BSA)在石英界面的吸附后信号强度随本体溶液浓度的增加呈线性关系。方法的检出限是94 ng·mL-1。用于实际人血清蛋白样品的测定,结果令人满意。     

金纳米棒表面等离子体共振瑞利散射能量转移光谱测定痕量硼

硼是一种生命体必需的微量元素,但过量的硼对人体以及动植物有害。建立一种高灵敏度,高选择性以及简便的硼检测方法,对于环境和人类健康都具有很重要的意义。本研究的目的是建立一种简便,灵敏,选择性测定硼的金纳米棒等离子体共振瑞利散射能量转移光谱新方法。直径为12 nm, 长度为37 nm的金纳米棒采用种子生长法制备。在pH 5.6的NH₄Ac-HAc的缓冲溶液中和甲亚胺-H存在下,金纳米棒在404 nm处产生较强的共振瑞利散射峰。当体系中存在硼酸时,硼酸与甲亚胺-H形成硼酸-甲亚胺-H配合物。作为散射受体的配合物与散射共振能量转移的给体纳金米棒靠近时,发生瑞利散射共振能量转移,导致瑞利散射信号猝灭。随着硼酸浓度的增加,形成的配合物增加,金纳米棒转移给黄色配合物的散射光能量增大,导致体系404 nm处的瑞利散射强度线性降低。其降低值ΔI_{404 nm}与硼的浓度在10～750 ng·mL-1范围内呈良好的线性关系。考察了共存物质对该法测定2.3×10-7 mol·L-1 B的干扰情况。结果表明该法具有较高的选择性,即4×10-4 mol·L-1的Mn2+,Cd2+,Zn2+,Bi3+,Na+,Al3+,葡萄糖,Hg2+,IO-₃,F-,SO2-₄,SiO2-₃,NO-₃,ClO-₄,过氧化氢等对硼的测定无干扰。据此建立了一个灵敏度高,选择性好,简便快速检测硼的瑞利散射共振能量转移新方法。     

核酸-甲基青莲6B分子作用体系的研究与应用

基于核酸对甲基青莲6B的减色效应,以阳离子型染料甲基青莲6B为生色探针,研究该染料与核酸的结合反应,建立了新的核酸测定体系,研究探讨了体系的作用机理。在pH＝9.0条件下,hs-DNA,sm-DNA, ct-DNA,yeast RNA的浓度与甲基青莲6B减色效应成线性关系,响应线性范围分别为0.50～4.00 μg·mL-1,0.20～5.00 μg·mL-1,0.20～5.00 μg·mL-1,0.20～4.50 μg·mL-1,检出限(3σ/K)分别为0.082,0.037,0.038,0.041 μg·mL-1。分析核酸合成样品,回收率为93.5%～105.0%。     

高效液相色谱化学发光测定中药制剂中2，3，5，4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷

研究了2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在硝酸介质中与高锰酸钾的发光行为和光谱现象,甲醛的存在可使化学发光强度大大增强。由于中药制剂成分复杂,干扰大,文章首次采用反相高效液相色谱化学发光技术,建立了一种测定中药制剂中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的新方法。对于不同中药制剂样品中2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷测定的回收率为102%～108%。方法的检出限为 11.83 μg·mL-1,线性范围为15.75～136.5 μg·mL-1,相对标准偏差为3.45 %(Cs=21.0 μg·mL-1,n=3)。此法简便、快速,重复性好,结果令人满意。     

粉防己碱与牛血清白蛋白相互作用的研究

利用荧光光培和紫外-可见吸收光谱,研究了粉防己碱与BSA相瓦作用的光谱学行为.研究结果表明,粉防己碱埘BSA有较强的荧光猝灭作用,静态猝灭和非辐射能量转移是导致粉防己碱猝火BSA内源荧光的主要原因.利用Stern-Volmer方程处理实验数据,获得了猝火常数Ksv,不同温度下的Ksv分别为1.26×104 L·mol-1(300 K),1.17×104 L·mol-1(310 K),1.12×104 L·mol-1(320 K).根据Forster非辐射能量转移理论计算出了粉防己碱与BSA间的结合距离r(300 K:3.24 nm;310 K:3.31 nm;320 K:3.50nm).此外,还求得了粉防己碱与BSA的结合常数KA(300 K:1.52×105 L·mol-1;310 K:2.03×105 L·mol-1;320 K:2.89×105 L·mol-1)及相应温度下的热力学参数,热力学数据表明二者主要靠疏水作用力结合.粉防己碱与BSA相互作用的同步荧光光谱表明,二者的结合对BSA构象产生了影响.     

胡椒酸乙酯与牛血清白蛋白的相互作用及金属离子的影响

采用荧光光谱研究了胡椒酸乙酯与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。实验结果表明:胡椒酸乙酯与BSA形成基态复合物从而猝灭BSA的内源性荧光,猝灭原因主要为静态猝灭和非辐射能量转移作用。胡椒酸乙酯对BSA的猝灭速率常数Kq为1.451×1013L.mol-1.s-1(25℃)和1.136×1013L.mol-1.s-1(37℃),胡椒酸乙酯与BSA的结合常数KA为9.484×105L.mol-1(25℃)和1.355×106L.mol-1(37℃),结合位点数n为1.18(25℃)和1.24(37℃)。根据Frster偶极-偶极非辐射能量转移理论得到结合距离r为2.68 nm(25℃)和2.81 nm(37℃)。通过热力学参数的计算,确定胡椒酸乙酯与牛血清白蛋白的相互作用是熵增加和吉布斯自由能降低的自发过程,主要作用力为疏水作用力。讨论了共存金属离子对胡椒酸乙酯与BSA的相互作用的影响。     

光谱法研究黄芩苷与牛血清白蛋白相互作用及其对蛋白质硝化的影响

运用荧光光谱法研究黄芩苷与牛血清白蛋白（BSA）在生理条件下（pH 7.4）的相互作用机制;紫外分光光度法检测黄芩苷对BSA酪氨酸残基硝化的影响。实验结果表明:黄芩苷对BSA的荧光猝灭类型为静态猝灭;T=287K和T=310K时,二者的结合常数Kn分别为1.02103×10⁸L·mol^-1和8.75709×10⁷L·mol^-1;二者的结合位点数n分别为1.62463和1.62899。由热力学参数确定黄芩苷与BSA之间的作用力类型为静电作用力。采用同步荧光技术确定了黄芩苷对BSA构象的影响。结合黄芩苷与牛血清白蛋白的相互作用机理,讨论了黄芩苷抑制蛋白质酪氨酸硝化的机制。