用鸡胚培养对虾白斑综合症病毒(WSSV)的研究

为探索对虾白斑综合症病毒(WSSV)能否在鸡胚中培养, 基于稳定培养体系, 将WSSV接种到SPF鸡胚中. 收获接种3d后死亡的鸡胚, 从中提取病毒; 将其再次接种到健康鸡胚中, 传代5次后, 由卵黄囊膜提取病毒, 将其经肌肉注射至克氏原螯虾, 结果实验组克氏原螯虾100%死亡, 而对照组无死亡情况. 对各代鸡胚及克氏原螯虾进行PCR和电镜检测, 实验组呈WSSV阳性; 电镜下, 死亡鸡胚细胞中可见大量正在组装的病毒粒子; 表明WSSV可用鸡胚进行培养.     

白斑综合症病毒超分支滚环检测试纸的构建及应用

依据白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)的囊膜蛋白VP28基因核苷酸序列设计特异的锁式探针,建立了WSSV超分支滚环扩增检测方法并构建试纸条.结果表明,WSSV超分支滚环扩增锁式探针在T4DNA连接酶作用下37℃连接30min,而后在Bst DNA聚合酶大片段作用下61℃反应50min,即能够实现病毒靶序列的有效检出.灵敏度实验表明,WSSV超分支滚环扩增试纸最低检出限为10拷贝/μL,是常规PCR(聚合酶链式反应)法灵敏度的100倍.特异性实验表明,该方法能够保证对WSSV的特异性检测.利用该试纸检测68份虾样本,与PCR方法检测结果基本一致,但更为灵敏和直观.     

Taura 综合征病毒主要结构蛋白的表达与纯化

根据Taura综合征病毒(TSV)基因组,设计特异性引物,从感染病毒组织中提取组织总RNA后扩增,分别将3个主要结构蛋白基因VP1、VP2和VP3克隆到pGEM TEasyVector.与表达载体连接后,导入大肠杆菌中诱导表达,并纯化目的蛋白.诱导表达的融合蛋白分子量分别为54.2×103、43×103和57.1×103,在变性条件下过柱纯化VP1和VP2,一次可以纯化10mg以上纯度较高的蛋白.     

池蝶蚌(Hyriopsis schlegeli)血淋巴的抗菌力、溶菌酶和酚氧化酶活力

通过分光光度法对池蝶蚌的抗菌力,溶菌酶和酚氧化酶活性进行了分析.结果表明,经嗜水气单胞菌感染后,池蝶蚌对这两种细菌的抗菌力分别为0.61±0.01 U和0.14±0.02U;所有实验组对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑制效果.随着年龄的增长,溶菌酶活性也显著增加,第4龄蚌的溶菌酶活力可达0.93±0.05U,比1龄蚌的酶活力高一倍左右;十二烷基磺酸钠(SDS)能够激活酚氧化酶(PO)酶原系统,2龄前,酚氧化酶活力逐渐增强,3龄和4龄逐渐减弱,2龄蚌的PO活性最高,为22.70±4.39 U.研究表明,池蝶蚌血淋巴中免疫因子的种类和表达活性在个体不同发育阶段中呈现出差异,推测可能与水体环境对蚌的作用有关.     

免疫多糖对日本溶菌酶和超氧化物歧化酶活性的影响

通过对日本(Charybdis japonica)进行免疫多糖、免疫多糖+溶藻弧菌、溶藻弧菌、生理盐水4种方法的处理,测定日本肝胰腺及肌肉中溶菌酶(LZM)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化,探讨免疫多糖对日本溶菌酶和超氧化物歧化酶活性的影响.结果表明：日本肝胰腺中LZM 和 SOD 的酶活均高于肌肉中的酶活,且免疫多糖对肝胰腺的免疫增强效应显著高于肌肉;免疫多糖组肝胰腺和肌肉中LZM酶活,在注射后24 h时显著升高至峰值(P<0.05),分别为(11.2±2.78) U·mg-1和(3.75±1.05) U·mg-1; SOD酶活也在24 h达到最高值,分别是对照组的2.2倍和1.4倍;免疫多糖+溶藻弧菌组在72 h时,肝胰腺和肌肉中的LZM酶活分别高出溶藻弧菌组62.8%和75.2%,2个组织中SOD酶活同样显著高于溶藻弧菌组(P<0.05),是溶藻弧菌组的3.5倍和4.2倍.由此可见,免疫多糖对日本免疫功能有增强作用,可以提高日本的抗病能力.     

抗鳗利斯顿氏菌鸡卵黄抗体制备及其活性研究

鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)是常见的水产动物致病菌.为获得高效抗 L. anguillarum卵黄抗体(egg yolk antibodies, IgY),用纯培养的L. anguillarum制备抗原,免疫蛋鸡,联用乙酸-乙酸钠稀释、(NH4)2SO4与 Na2SO4盐析、透析法由蛋黄分离纯化 IgY.对制备的 IgY进行了体内、外抑菌与吞噬调理活性研究:分别将抗L. anguillarum 的IgY、由普通鸡蛋IgY与L. anguillarum (103 CFU·mL-1)等体积混合后注射克氏原螯虾(Procambarus clarkia),计算成活率;分别将抗L. anguillarum的IgY、普通鸡蛋IgY与L. anguillarum (106 CFU·mL-1)及血细胞混合后,接种平板培养、计数.结果表明,提取的IgY浓度为8.93 mg·mL-1,每个鸡蛋可获得IgY约120 mg,抗体纯度较高,效价为1:20480;体外抑菌率为65%;能促进细胞吞噬L. anguillarum,相对吞噬率为75%;对克氏原螯虾的保护率为33.3%.     

鸭源H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆、序列分析及原核表达

参照GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计并合成引物,以鸭源H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,利用RT PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18 T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子.测序结果表明HA基因长为1683bp.基于HA蛋白的信号肽在表达中的负面作用,本研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码序列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,并将其亚克隆到pGEX KG中,与GST融合表达.SDS PAGE结果显示:融合表达的蛋白分子量约为90×103.Western印迹表明表达蛋白具有免疫活性.     

表达5aG株狂犬病毒糖蛋白基因的重组痘苗病毒的构建及鉴定

采用同源重组的方法，将５ａＧ株狂犬病毒糖蛋白基因插入天坛株痘苗病毒基因组ＴＫ区段，置于痘苗病毒晚期启动子Ｐ１１控制之下，通过筛选，得到一株重组病毒ＶＶａＧ，实验结果表明：该株病毒可表达５ａＧ株糖蛋白基因，表达产物位于感染细胞膜表面，分子量６４×１０３，并可与抗狂犬病毒糖蛋白单抗特异结合，用ＶＶａＧ免疫小鼠，可诱导机体产生抗狂犬病毒中和抗体，抵抗致死剂量狂犬病毒的攻击，中和抗体滴度在免疫后１４ｄ达到高峰，为１５６０．     

pH突变对拟穴青蟹免疫因子的胁迫影响

以拟穴青蟹为材料,在实验室条件下测定了pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5各梯度胁迫0h、24h、48h、72h、96h时青蟹的血细胞总数（THC）、血细胞吞噬能力及血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）、过氧化物酶（POD）、酚氧化酶（PO）及溶血素等相关免疫因子的活力变化.结果表明：长时间胁迫使各免疫指标值下降,显示可抑制免疫因子的活性,其中THC、LZM和溶血素活力下降明显.小幅度（pH 7.05、pH 8.02）突变下短时间内各项指标值有所上升,而后下降;大幅度（pH 6.45、pH 8.44）突变各项指标值显著降低.pH胁迫24h后对照组的THC显著高于其他各组;pH 7.05、pH 6.45、pH 8.02组的溶血素活力显著低于对照组;pH 8.44、pH 6.45组的血细胞吞噬作用和ACP活力显著低于对照组.可见THC、溶血素、血细胞吞噬能力、PO和POD可作为pH胁迫对拟穴青蟹抗病力影响的重要参考依据.     

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)应急二价铜离子时超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的变化

用二价铜离子(Cu2+)胁迫克氏原螯虾,分析其肝胰腺、触角腺、鳃等组织的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性变化.结果表明:克氏原螯虾能在含10mg/LCu2+水中生活;在10mg/LCu2+胁迫下,在0～24h,肝胰腺和触角腺中的CAT、SOD活性均显著升高,CAT活性在24h达到最高;在24～36h,肝胰腺和触角腺中的CAT活性开始下降,而SOD活性继续上升,在第36h时达到最高;48h后,肝胰腺和触角腺中SOD和SOD活性下降并均趋于平稳表达,SOD活性仍显著高于非胁迫处理时,而CAT活性则显著低于Cu2+处理时;鳃中的SOD和SOD活性未受到Cu2+浓度变化的影响.     

氨态氮、亚硝态氮对罗氏沼虾免疫相关酶类的影响

氨态氮和亚硝态氮是虾类养殖环境中最主要的污染物.在1 mg/L非离子氨态氮和1 mg/L亚硝态氮的作用条件下,罗氏沼虾血清、肝胰腺和肌肉中的酚氧化酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶及酸性磷酸酶活力变化不同,经1、4、7及10天处理后,血清和肌肉酚氧化酶活力均有所降低,而肝胰腺的酚氧化酶活力则略有增高;各组织中的超氧化物歧化酶活力基本变化过程为,先增高后降低;各组织的两种磷酸酶活力则有不同程度的增高.酚氧化酶与超氧化物歧化酶活性可作为判断虾类免疫抗病能力的指标,而两种磷酸酶活性则仅可作辅助参数.     

RT-PCR技术在凡纳滨对虾健康苗种培育中的应用

应用PCR和RT-PCR技术对WSSV、IHHNV和TSV这3种对虾病毒在凡纳滨对虾育苗过程中各个环节进行了检测，防止亲虾、卵、无节幼体、仔虾、亲虾饵料、丰年虫、水体等诸环节受到以上3种病毒携带或感染，保证培育出的凡纳滨对虾仔虾是高健康的虾苗，为凡纳滨对虾健康养殖的可持续发展提供一条可行的途径．     

3种海产蟹类血淋巴酶活性的初步研究

利用API ZYM试剂盒和酶活力测试盒检测了拟穴青蟹、三疣梭子蟹和日本好3种海产蟹血淋巴中的19种酶及血清中6种免疫相关酶的活性.结果表明:有5种酶在3种蟹血淋巴中含量较高,有3种酶在3种蟹血淋巴中含量较少或没有.血清中酚氧化酶(PO)和溶花菌酶(LZM)活力日本(虫寻)最高,拟穴青蟹最低,拟穴青蟹与其他 2种蟹差异显著(P<0.01),三疣梭子蟹和日本(虫寻)之间无明显差异;碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活力拟穴青蟹最高,三疣梭子蟹最低,拟穴青蟹与三疣梭子蟹差异显著(P<0.05),日本(虫寻)与其他2种蟹无明显差异;酸性磷酸酶(ACP)活力在3种海蟹之间无显著差异.     

蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用,具有无耐药性、无残留等特点,被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素,改善滥用抗生素所引起的一系列问题,市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势,由于目前生产的菌株表达量偏低,限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量,根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化,并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL,经遗传霉素G418抗性筛选后,获得了一株酵母转化子(G-p-coEWL),其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL^-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h,实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中,总蛋白浓度为 607 mg·L^-1,酶活达到677 U·mL^-1。此外,本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到 Sephadex G-50的分离效果更好,并在14.4 kDa处得到单一的溶菌酶条带。     

蛋清溶菌酶基因的密码子优化及其在毕赤酵母中的分泌表达

作为一种天然的抑菌物质,溶菌酶对抗生素耐药菌有较强的杀伤作用,具有无耐药性、无残留等特点,被认为在诸如动物饲料、药品等领域可有效代替抗生素,改善滥用抗生素所引起的一系列问题,市场前景巨大。通过微生物发酵大规模生产重组溶菌酶符合市场发展趋势,由于目前生产的菌株表达量偏低,限制了溶菌酶的应用和产业化发展。为提高蛋清溶菌酶的发酵表达量,根据毕赤酵母密码子的偏爱性,对其编码基因进行密码子优化,并构建了真核分泌表达载体pPIC9K-coEWL,经遗传霉素G418抗性筛选后,获得了一株酵母转化子(G-p-coEWL),其对G418的抗性浓度高达15 mg·mL^-1。在28℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1和甲醇浓度1%的诱导条件下,酵母重组子G-p-coEWL经摇瓶培养72 h,实现了蛋清溶菌酶的分泌表达。在发酵上清液中,总蛋白浓度为 607 mg·L^-1,酶活达到677 U·mL^-1。此外,本实验还比较了葡聚糖凝胶柱Sephadex G-50和强酸性阳离子交换柱SP-Sepharose FF两种方法对目的蛋白的分离效果,得到 Sephadex G-50的分离效果更好,并在14.4 kDa处得到单一的溶菌酶条带。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E1在小鼠和家兔中免疫应答研究

探讨丙型肝炎病毒包膜蛋白E1作为丙肝候选疫苗的可行性．用大肠杆菌表达的非糖基化HCV(丙型肝炎病毒)E1包涵体蛋白免疫小鼠和家兔，分析该包涵体蛋白在小鼠和家兔中所引起的免疫应答及其安全性．该E1蛋白具有良好的免疫原性，能诱导小鼠和家兔产生针对E1的特异性体液免疫应答．小鼠CD8^ T细胞数量在免疫后有明显升高．免疫小鼠未见明显的毒副作用．推测HCV E1这种包涵体结构可能有利于E1抗原的呈递．而HCV E1蛋白的糖基化并不是其免疫原性所必须的．     

埃可病毒18型构象表位的生物信息学研究

埃可病毒18型(Echovirus 18,E18)可引起手足口病、病毒性脑膜炎和急性胃肠炎等疾病,近20年来开始在全球流行.本文首先使用前期研发的人肠道病毒构象表位的生物信息学预测算法,对肠道病毒B种的E18构象表位进行系统性预测,发现其表位分布模式呈三簇分布,其中VP1 BC环和C-端、VP2 EF环是E18表位的主要构成区域;其次基于E18的VP1和基因组序列的分子进化分析发现,进化分支的形成伴随表位处氨基酸突变,而VP1 C-端和VP2 EF环是突变热点区域;最后通过足迹图发现,大多数E18衣壳表面的分支突变都位于表位上或附近,受体结合位置处的突变罕见,提示表位处的突变产生了新的进化分支,但分支突变尽量避开受体结合位置,以免影响病毒与宿主细胞的结合能力.E18构象表位的生物信息学研究,为进一步通过实验鉴定表位、病毒的监测和预警以及抗病毒药物和疫苗的研发提供了重要支持.     

密码子优化的人溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗菌活性分析

人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）是一种天然活性蛋白质,具有抗菌性,目前主要应用于食品添加剂、动物饲料、药物治疗领域。根据毕赤酵母表达偏爱密码子特点,通过优化hlyz基因密码子,人工合成目的基因,构建了分泌表达载体pPIC9K-hlyz。通过电击转化法将pPIC9K-hly质粒重组至毕赤酵母GS115染色体中,经筛选得到重组毕赤酵母GS115-pPIC9K-hlyz。在28 ℃、pH 6.0、转速240 r·min^-1、1%甲醇诱导下表达120 h,发酵液上清酶活达到最高,为（2 414.9±108.1）U·mL^-1,蛋白浓度为166.7 μg·mL^-1。发酵液上清经过Sephadex G50纯化,获得较纯的hLYZ,经SDS-PAGE分析,在近14.7 kDa处显示单一条带。抗菌实验结果表明,重组hLYZ对革兰氏阳性菌的抗菌效果大于革兰氏阴性菌;重组hLYZ的抗菌效果是hLYZ标准品的10~20倍。