基因免疫诱导小鼠对狂犬病病毒糖蛋白的免疫反应

将狂犬病病毒糖蛋白基因（Ｒｇｐ）按正确方向插入真核表达载体ｐＫＳＶ１０及ｐＭＴ０１０／Ａ＋中相应启动子下游，构建成由ＳＶ４０早期启动子启动的ｐＫＳＶＲｇｐ及羊金属硫蛋白启动子启动的ｐＭＴＲｇｐ两种狂犬病病毒糖蛋白表达载体．将两种重组体分别经小鼠两侧腿部肌肉按不同方案直接注射到１２只６～８周龄小鼠体内，成功地在注射小鼠血清内检测到抗狂犬病病毒抗体，而且注射２次的小鼠ＥＬＩＳＡ抗体滴度显著提高，并且ｐＫＳＶＲｇｐ诱生的抗体滴度更高．     

蝎神经毒素AaIT的表达及功能分析

在不改变氨基酸编码序列的情况下，根据大肠杆菌密码子偏爱性，设计并人工合成了适合于大肠杆菌表达的蝎神经毒素AaIT基因．将该基因插入到大肠杆菌表达载体PET32a＋中，得到重组质粒PET32a-AaIT，将该质粒转入带有trxB／gor双突变的大肠杆菌Origami（DE3），重组菌株经IPTG诱导后，获得町溶性表达产物，但该表达产物没有生物学活性．把此基因插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC6αA构建重组质粒pPIC6αA-AalT，转化毕赤酵母（X-33），经甲醇诱导后，获得高水平的分泌表达（20mg／L）．表达产物喂食银纹夜蛾及甜菜夜蛾没有表现出生物活性，经注射有活性．     

小鼠卵透明带3(mZP3)cDNA的克隆、测序及mZP3 DNA疫苗的构建

卵透明带3（ZP3）蛋白是透明带中的一种主要蛋白，在精卵结合过程中作为精子的初级受体起重要的作用，抗ZP3抗体可以阻断精卵的相互作用，ZP3被认为是一种潜在的避孕疫苗的靶抗原，本文根据小鼠卵透明带（mZP3)cDNA序列（1317bp）设计了上游和下游引物，从小鼠卵巢中提取总RNA，经RT－PCR克隆了鼠卵透明带3基因的cDNA，将其亚克隆至pUCm-T载体后利用蓝白斑特性筛选出阳性克隆，酶切鉴定后测序比较，与Gene Bank小鼠ZP3 cDNA序列完全相同，证明克隆出正确的小鼠ZP3 cDNA。将mZP3克隆至真核表达质粒pCMV4上，构建完成了DNA避孕疫苗的载体pCMV4-mZP3，为应用DNA疫苗免疫小鼠达到控制鼠害的研究奠定了基础。     

人白细胞介素10(hIL10)在毕赤酵母中的表达

利用PCR技术从质粒pcDNA3．1／GS扩增得到hIL10基因．将其插入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K／IL10，转化毕赤酵母GS115，筛选出整合了多拷贝白细胞介素10基因的菌株，经摇瓶培养，0．5％甲醇诱导表达、SDS-PAGE分析显示，表达产物以可溶性分子形式存在于上清中，诱导4d的表达量达到高峰．Western印迹表明．表达产物具有良好的抗原性和特异性．     

重组真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ的构建及其在胃癌细胞MGC80—3中的表达

目的构建新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因的真核表达载体pEGFP—C1／cecropin—XJ（pEGFP—cec），检测其在肿瘤细胞中的表达情况，探讨抗菌肽对肿瘤细胞的作用机制和抗菌肽抑瘤作用效果．方法应用基因重组技术，将新疆家蚕抗菌肽（cecropin—XJ）基因克隆到真核表达载体pEGFP—C1，通过酶切和测序的方法鉴定重组质粒pEGFP—cec的正确性．将pEGFP—cec经脂质体法转染到胃癌细胞MGc80—3，48h后观察EGFP瞬时表达情况；72h后，应用RT—PCR，检测抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；96h后，消化细胞，经台盼蓝染色，检测重组质粒pEGFP—cec表达产物对肿瘤细胞的影响．结果细胞转染48h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达，发出绿色荧光；转染72h后，RT—PCR检测到胞内有抗菌肽cecropin—XJ基因的表达；表达产物能够抑制肿瘤细胞的生长．结论成功构建了真核表达载体pEGFP—cec，并在肿瘤细胞中可见抗菌肽cecropin—XJ和EGFP基因的有效表达以及表达产物具有显著的抗肿瘤活性．为深入开展抗菌肽抑制肿瘤的研究奠定基础．     

伪狂犬病毒TK基因转移载体构建及LacZ基因表达

在扩增、克隆PRVtk、gH基因的基础上,构建了包含tk和gH基因片段的转移载体质粒pTK2．5．以PRV糖蛋白gG启动子(PgG)为控制外源基因表达的启动子,以E．colilacZ为报道基因,用其替换pTK2．5质粒tk区的Sall与Xhol之间的序列,构建了转移载体质粒pTK．LacZ．瞬时表达证实,转染细胞的pTK—lacZ质粒在野生型PRV感染的情况下,能有效表达β-Gal酶活性．将pTK．1acZ转染BHK21细胞后再以PRV感染进行同源重组,在143TK-细胞上经5．溴脱氧尿苷选择,Vero细胞纯化,X-GaI染色,蓝斑筛选,分离到重组体PRV(rPRV)．rPRV与野生型PRV在细胞上具有类似的生长特性,且经过连续传代的rPRV仍能稳定的表达β-Gal酶活性．     

重组人白细胞介素—β对小鼠玻璃化冷冻桑椹胚体外生长发育和移植存活率影响的研究

研究探讨了重组人白细胞介素－β（rhIL-1β）对小鼠玻璃化冷冻桑椹胚体外生长发育和移植存活率的影响作用。结果表明：培养液中重组人白细胞介素－1β浓度为50IU／mL时，对小鼠玻璃化冷冻胚胎的体外生长发育无明显的影响，当浓度为5，500，5000IU／mL时，对胚胎的生长发育具有明显的抑制作用；小鼠玻璃化冷冻胚胎解冻后，经过5，5，50，500IU／mL重组人白细胞介素－1β，3-4h的短期处理后，胚胎妊娠率明显提高，其中50IU／mL处理组（100％）与对照组（56．25％）相比差异显著（P＜0．05），而5000IU／mL处理组（33．33％）的胚胎妊娠率明显降低，与对照组（56．25％）相比差异显著（P＜0．05），本研究表明50IU／mL重组人白细胞介素－β的短期处理可能提高母体对冷冻胚胎的接受能力，高浓度重组人白细胞介素－β对小鼠胚胎可能具有直接的毒性作用。     

葡萄球菌肠毒素B基因原核表达系统的构建及其表达产物促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的研究

构建葡萄球菌肠毒素B（staphylococcal enterotoxins B,SEB）基因原核表达系统,了解重组表达产物rSEB促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用．采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌FRIS6B株DNA中扩增全长SEB基因片段,T—A克隆后测序,构建SEB基因原核表达系统pET32α-SEB—E．coliBL2IDE3．采用SDS-PAGE检测rSEB表达产量,Ni—NTA亲和层析法提纯rSEB．采用TCID50法测定rSEB对Vero细胞的细胞毒性作用并计算TCID50值．采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEB体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝腺癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用．与公布的相关序列比较,所克隆的SEB基因核苷酸序列相似性为100％．rSEB表达量约为细菌总蛋白的40％．rSEB对Vero细胞的TCIC50为3．02μg．5．0～20．0μg／ml的rSEB对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P〈0．05）．5．0～20．0μg／ml rSEB作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P〈0．05）．本研究成功地构建了rSEB高效原核表达系统．rSEB仍然具有生物学活性．所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法,为以后减毒rSEB突变体的筛选奠定了基础．     

用宿主范围扩大的重组AcNPV在家蚕中表达TNF

用宿主范围扩大的核型多角体病毒双穿梭载体Bonpvid与重组转座质粒 pFast-TNF转座，使含有有TNF基因的表达盒插入Bonpvid的Tn7att的接受位点筛选阳性重组E.coli菌落，将提取的阳性重组子DNA分别转染家蚕BmN细胞和Sf-9细胞，获得了能表达TNF的重组病毒，SDS－PAGE和Western blot分析表明，TNF在上述两种细胞中得到表达，以家蚕作为生物反应器，将含有重组病毒的的细胞上清注射感染家蚕4龄幼虫，使TNF在蚕体表达，用BmN细胞中表达的TNF感梁肿瘤细胞，诱导细胞发生了凋亡。     

HPV16-E7在Pichia Pastoiris酵母中的分泌表达

本研究利用酵母Pichia pastoris真核表达系统表达人乳头瘤病毒16(HPVl6)E7蛋白，试图解决新疆维吾尔妇女高发宫颈癌的诊断、疫苗的研究中抗原蛋白需要的问题。依据新疆维吾尔妇女宫颈癌组织克隆获得的HPVl6—E7基因序列设计引物，并分别在5’引物和3’引物中引入了EcoR I和Xba I酵切位点，经RCR扩增后连接到pMDl8—T载体上，再将HPVl6—E7克隆至穿梭质粒pGAPZαA上，获得的重组穿梭质粒pGAPZαA—E7经线性化后，采用UiCl法将重组穿梭质粒转入酵母细胞内，Zeocin 筛选阳性克隆，经小瓶发酵后，取上清作SDS-PAGE，并做Western印迹检测表达的蛋白质，结果表明HPVl6-E7成功地在酵母真核表达系统获得表达，表达产物的分子量分别是22KDa和88KDa，为深入开展HPVl6-E7蛋白功能和应用的研究奠定了理论基础。     

黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据黑曲霉F044脂肪酶N-端氨基酸序列，运用生物信息学方法，找到与黑曲霉脂肪酶基因同源的候选基因A84689．根据该基因序列，设计引物直接经RT—PCR扩增得到黑曲霉脂肪酶全长基因anl．anl全长1044bp，含3个内含子，编码297个氨基酸（含信号肽27个氨基酸），与其他脂肪酶基因没有明显的同源性．将成熟脂肪酶基因连接到pPIC9K载体上得到重组表达质粒，转化P．pastoris GSll5．脂肪酶基因在P．pastoris GSll5中实现了分泌性表达．     

重组人白细胞介素-1β对小鼠玻璃化冷冻桑椹胚体外生长发育和移植存活率影响的研究

研究探讨了重组人白细胞介素-1p(rhIL-1β)对小鼠玻璃化冷冻桑椹胚体外生长发育和移植存活率的影响作用.结果表明:培养液中重组人白细胞介素-1β浓度为50IU/mL时,对小鼠玻璃化冷冻胚胎的体外生长发育无明显的影响,当浓度为5,500,5 000IU/mL时,对胚胎的生长发育具有明显的抑制作用;小鼠玻璃化冷冻胚胎解冻后,经过5,5,50,500IU/mL重组人白细胞介素-1β,3-4 h的短期处理后,胚胎妊娠率明显提高,其中50IU/mL处理组(100%)与对照组(56.25%)相比差异显著(P＜0.05),而5 000IU/mL处理组(33.33%)的胚胎妊娠率明显降低,与对照组(56.25%)相比差异显著(P＜0.05).本研究表明50IU/mL重组人白细胞介素-1β的短期处理可能提高母体对冷冻胚胎的接受能力.高浓度重组人白细胞介素-1β对小鼠胚胎可能具有直接的毒性作用.     

二氧化硒对带瘤小鼠免疫功能的影响

本文通过实验证明,硒化物对小鼠的艾氏腹水瘤有明显的抑瘤效果,并且用血凝试验及淋巴细胞α—醋酸萘酯酸性酯酶标记技术(ANAE~ )分别检测硒化物治疗肿瘤过程中的体液免疫和细胞免疫功能的动态变化. 实验采用纯系BALB/C小鼠,体重为21±2克;腹腔接种艾氏腹水瘤(EA),数量是4×10~6/0.2ml/每鼠.给硒组小鼠在接瘤后当天注射二氧化硒(SeO_2),剂量为20μg/0.2ml/每鼠,以后每隔一天注射一次,共五次;不给硒组注入同量生理盐水.并分别于6—8天(早期)、10—13天(中期)、15—18天(晚期)处死,同时进行血凝试验和ANAE~ 细胞检测.处死前5天,采用5％绵羊红血球(SRBC)免疫,每鼠腹     

pEGFP-MEK1/Q56P重组质粒的构建及融合基因在293T细胞中的表达

构建第56位氨基酸发生突变的MEK1基因(MEK1／Q56P)与增强绿色荧光蛋白(EGFP)报道基因融合表达的真核重组质粒pEGFP-MEK1／Q56P，经限制性酶切及测序鉴定后，将其导入293T细胞中，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，同时进行Western blot检测。酶切鉴定及测序结果表明构建的pEGFP-MEK1／Q56P与预期结果一致，荧光观察及Western blot结果表明MEK1／Q56P和EGFP在293T细胞中能以融合蛋白的形式表达，且MEK1／Q56P能特异性活化ERK1／2，本研究成功构建了含有MEK1／Q56P的绿色荧光蛋白真核表达质粒，便于对Raf／MEK1／ERK1／2信号传导通路做进一步研究。     

硒化合物在小鼠中的抑瘤效应

小鼠在分别接种EAC,HAC,ARS,L_(7712),L_(615)和S_(180)瘤细胞后,用剂量为7.5—30μgSe/鼠/次的SeO_2,Na_2SeO_3,NaHSeO_4,H_2SeO_3等硒化物进行抑瘤实验,结果证明,经腹腔注射给药对EAC,HAC,ARS等腹水型肿瘤都有显著的的抑瘤效应,各种硒化物之间没有明显的差别。经皮下注射SeO_2对EAC的抑制作用不明显。S_(180)经皮下同位注射较乏对侧位注射的抑制效果为好。据此可以认为硒化合物的抑瘤作用是由于硒对瘤细胞的直接杀伤所致,因此具有广谱的抑瘤效应。根据对实验小瘤的体重、肝、脾重量以及血相变化判断,在实验所用的剂量范围内,硒化物治疗的小鼠没有明显的毒性反应。本文还讨论了硒剂应用于临床的可能性问题。     

新疆家蚕抗菌肽(Cecropin-XJ)在Pichia pastoris中的表达

研究目的是在Pichia pastoris真核表达系统中分泌表达新疆家蚕抗菌肽(cecropin-XJ)．将pMDl8-T-cecropin-XJ上的抗菌肽基因cecropin-XJ亚克隆至穿梭质粒pGAPZaA上．用AvrII酶切使之线性化后．采用LiCl法转化Pichia pastoris SMDll68,转化子经小瓶发酵,结果表明重组cecropin-XJ可以在α因子的引导下，分泌到培养基中，表达产物的分子量在14．4KDa～20．1KDa与31．0KDa～43．0KDa之间，各有一条特异性的条带，且表达产物有明显的抑菌活性和热稳定性．这一发现为抗菌肽在农业、医疗卫生、畜牧业等方面的应用奠定基础，同时为深入研究抗菌肽作用机制提供了依据．     

浙江海域墨西哥湾扇贝生长的研究

2000年4月至12月对浙江海域养殖墨西哥湾扇贝的生长进行了详细的观察．初期D形幼虫壳长95-100μm，经10-13d的培育壳高达到190-205μm，平均日增长7．7-10．1μm；稚贝附着后13d平均壳高从198．2μm增长到670．5μm，平均日增长36．4μm；出库稚贝暂养于围塘内，培育60d平均壳高达到25．12mm，成为商品贝苗，平均日增长0．4mm；再经5个月养殖达到成品贝，平均壳高53．2mm，平均体重45．5g．墨西哥湾扇贝是一种快生型贝类．对室内浮游幼虫、稚贝、中间暂养贝苗、成贝养殖期间的多项生长指标进行测量和称重，获得的相关关系非常显著．     

蓝舌病毒HbC3株S7基因5’非编码区序列分析

根据已发表的蓝舌病毒(bluetongue virus．BTV)10型标准株S7基因设计合成一对与其5'-NCR(noncoding region)序列同源的引物．经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出HbC3株和10型标准株长度分别为277bp和290bp的S7基因5’非编码区cDNA片段．以建立起dsRNA体外扩增系统．将扩增的BTV-HbC3毒株的S7基因5’非编码区片段通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中．用PCR技术和限制性内切酶分析鉴定，表明获得重组质粒pUCm-T-BTV-HbC3-S7．通过核苷酸序列分析方法分别将2个毒株的S7基因5’非编码区与呼肠孤病毒-3(reovirus-3)型比对。发现BTV-HbC3株与呼肠孤病毒-3 L2基因5’非编码区基因具有完全的同源性．将BTV-HbC3毒株接种在不同细胞系如猴肾传代细胞(Vero)、人肝癌细胞(Hep-3B)和小鼠成纤维细胞(L929)等细胞株上，比较BTV-HbC3在不同种系细胞上的增殖特征，并且用双向免疫扩散试验证实BTV-HbC3和BTV-10型之间的血清学关系．结合本实验室的研究结果提示BTV-HbC3株可能是蓝舌病毒的一个新的基因型．     

抑制性消减杂交方法的建立

为建立研究基因表达差异的抑制性消减杂交（SSH）方法，以未加诱导剂处理的结肠癌LoVo细胞提取的mRNA为模板合成的cDNA作为驱赶子（driver)，联合使用10.0μmol/LATRA和0.1μmol/L1,25-(OH)2D3诱导2d的LoVo细胞提取的mRNA为模板合成的cDNA作为测试子（tester)进行SSH实验，结果为：消减产物与未消减样品（对照）在琼脂糖凝胶电泳图谱上明显不同，前者可见一些扩增条带，其大小范围在100-1000bp之间，本实验说明SSH方法对于识别差异表达的基因具有高效性。     

蓝舌病毒HbC3株S7基因5′非编码区序列分析

根据已发表的蓝舌病毒(bluetongue virus,BTV)10型标准株S7基因设计合成一对与其5′-NCR (noncoding region)序列同源的引物, 经反转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 扩增出 HbC3株和10型标准株长度分别为277 bp和290 bp的S7基因5′非编码区cDNA片段, 以建立起dsRNA体外扩增系统.将扩增的BTV-HbC3毒株的S7基因5′非编码区片段通过粘端连接克隆到pUCm-T载体中, 用PCR技术和限制性内切酶分析鉴定, 表明获得重组质粒pUCm-T-BTV-HbC3-S7.通过核苷酸序列分析方法分别将2个毒株的S7基因5′非编码区与呼肠孤病毒-3 (reovirus-3) 型比对, 发现BTV-HbC3株与呼肠孤病毒-3 L2基因5′非编码区基因具有完全的同源性.将BTV-HbC3毒株接种在不同细胞系如猴肾传代细胞(Vero)、人肝癌细胞(Hep-3B)和小鼠成纤维细胞(L929)等细胞株上,比较BTV-HbC3在不同种系细胞上的增殖特征,并且用双向免疫扩散试验证实BTV-HbC3和BTV-10型之间的血清学关系.结合本实验室的研究结果提示BTV-HbC3株可能是蓝舌病毒的一个新的基因型.