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SARS病毒核衣壳蛋白的表达与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
依据Genebank中SARS基因组序列和酵母菌对密码子的选择性,采用人工合成的方法,合成了优化的SARS病毒核衣壳蛋白(N)的全基因(1296bp),与CTL表位基因(195bp)重组后,将其克隆到酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建成重组表达载体pPIC9K-N.重组载体转化毕赤酵母GS115,并经MD平板和MM平板筛选及PCR鉴定,得到阳性重组酵母工程菌GS115-pPIC9K-N.用甲醇诱导其分泌表达目的蛋白并对表达产物进行分析、浓缩与鉴定.结果表明,SARS病毒核衣壳蛋白能实现在毕赤酵母中高效表达,表达量达到20%,初步纯化后的产物具有良好的抗原特异性. 相似文献
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口蹄疫病毒3ABC基因截短体在毕赤酵母中的表达及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
将长为525 bp的口蹄疫病毒3ABC基因截短体克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中, 构建了重组表达质粒pPIC9K-3ABCt. 用BglⅡ线性化后, 电转化毕赤酵母菌GS115, 经表型筛选, PCR鉴定, 获得阳性重组菌(GS115/pPIC9K-3ABCt). 然后进行诱导表达, 通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果表明, 重组菌株成功分泌表达了分子量为40000, 具有免疫反应活性, 且呈二聚体形式的目的蛋白. 在96 h时表达量达到最高峰, 占分泌总蛋白的18%, 达到23.4 mg/L. 为进一步研制口蹄疫免疫和感染动物鉴别诊断试剂奠定了基础. 相似文献
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肠道病毒71型外壳蛋白VP2在Pichia.pastoris酵母中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法,克隆肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)SHZH03株外壳蛋白VP2基因,构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/VP2,经序列测定证实α-factor信号肽和VP2的序列和阅读框正确后,用SacI酶切使之线性化,电转化法将目的基因整合到宿主菌GS115基因组上;经转化子表型筛选和PCR分析鉴定后,甲醇诱导筛选到高效表达VP2蛋白的工程菌株.用饱和硫酸铵法对重组蛋白VP2进行了较好的纯化.Western Blot分析表明,重组蛋白VP2具有较好的反应原性,从而为发展EV71快速、高效、廉价诊断试剂奠定了基础. 相似文献
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《高等学校化学学报》2018,(11)
将人参皂苷β-葡萄糖苷酶(Glu GF)基因与表达载体p PIC9K连接,构建重组质粒,转化至毕赤酵母中表达,并用于人参皂苷Rb1的催化转化.研究结果表明,成功构建了重组表达质粒p PIC9K-GluGF,转化后筛选到阳性重组毕赤酵母菌.重组菌产酶的最佳甲醇诱导体积为0. 5%,诱导时间为168 h.重组菌诱导培养制备的粗酶液具有Glu GF的活性,可以水解人参皂苷Rb1,产物中皂苷C-K含量达到0. 09 mg/mL,粗酶液中Glu GF的比活力为0. 67 U/mg. 相似文献
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以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础, 通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A, SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41, 线性化后, 采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中, 经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子. 摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明, 目的蛋白得到良好表达, 表达量最高可达到47.9 mg/L. 目的蛋白经初步纯化后, 用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究, 结果显示, 目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应, 并可介导特异的CTL反应, 对靶细胞具有明显的杀伤活性, 表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂. 相似文献
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从病人血清中经过聚合酶链反应扩增得到了编码HBV-M蛋白的基因片段(PreS2+S),将其转入原核表达载体pET-His,构建了原核表达质粒pET-His-M。重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,收获菌体超声波破碎后,蔗糖梯度溶液洗脱杂质。HBV-M在原核系统中高效表达,分子量为30kD,纯化后得到了纯度为98%的HBV-M蛋白,ELISA检测结构表明M蛋白的抗原性比S蛋白的抗原性强。该研究为进一步研究HBV包膜M蛋白的结构、功能及新型乙肝疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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本文提出了一种利用酵母转座子Ty因子的新战略.本文中构建的酵母整合型质粒含有TyH25片段,利用这一片段与染色体之间的同源重组,可把质粒上的目的基因带入染色体,并可获得相当稳定的表达.本文还报道了GAL4基因和CUP1基因的稳定表达.脉冲梯度电场电泳(PFGE)揭示,质粒上的同一基因可以整合到不同的染色体上.Southern杂交分析表明,质粒整合的靶位点具有较高的结构相似性;整合后的质粒可以以单拷贝形式,也可以成串排列的多拷贝形式存在.我们还发现,随着整合情况的不同,质粒中同一目的基因在不同转化子中表达的情况也不尽相同. 相似文献
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利用基因工程方法在大肠杆菌-酶母穿梭质粒pPIC9K上构建了人三叶因子3(HumanTrefoilFactor3,hTFF3)双结构域突奕体基因,采用毕氏酵母表达系统对目的基因进行了分泌表达。经S-Sepharose,Q-Sepharose,SephacrylS-100纯化后得到突变体蛋白,主要以单体形式存在。SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为12000,并在Westernblotting印迹实验中证明能被抗hTFF3抗体所识别,N-端氨基酸测序与天然hTFF3-一致,质谱检测纯化的蛋白出现单体和双体两种形式。用重组蛋白对乙醇诱导的大鼠胃溃疡进行实验治疗表明hTFF3双体突变体与天然形成的双体蛋白具有相同的活力,并且活力高于单体形式的hTFF3。 相似文献
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以含猪IL-18全基因的重组质粒pGEM-IL-18为模板,PCR扩增猪IL-18成熟蛋白基因.将IL-18成熟蛋白片段定向插入原核表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-IL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白(His-IL-18),并进行融合蛋白的纯化、生物学活性鉴定.结果表明,SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为2.1×104的融合蛋白,westem blot证实His-IL-18能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应.重组猪IL-18经纯化后,能明显刺激猪脾脏T淋巴细胞增殖反应,在Marc-145细胞上抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的活性为2.50×103IU/mg,在PK-15细胞上抗猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的活性分别为2.00×103和2.24×103IU/mg.表明建立的表达系统能够表达重组猪IL-18,表达的重组猪IL-18具有一定的生物学活性. 相似文献
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粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶,通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移等过程.采用PCR方法,从Flag-FAK质粒中克隆编码FAK C端273个氨基酸的基因片段,构建FAK融合蛋白原核表达载体pET28a( )/FAK,进行原核表达与蛋白纯化,取纯化的FAK蛋白免疫小鼠,制备FAK抗血清.结果表明构建的表达FAK C端功能结构域的原核表达质粒pET28a( )/FAK,经过BL21(DE3)大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子质量约33 kDa的融合蛋白,并利用小鼠制备了多克隆抗体,EL ISA检测显示该抗体有较高效价.荧光免疫结果显示此多克隆抗体与FAK蛋白特异性结合,为进一步研究神经细胞中FAK的作用机制奠定了基础. 相似文献
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肠道病毒71型外壳蛋白VP1在大肠杆菌中的表达 总被引:4,自引:0,他引:4
将扩增得到的肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆到测序载体pGEM-T,测序验证该序列为目的片段后,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX-5x-1中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE分析和Western blot验证。结果表明,在经IPTG诱导的BL21中检测到分子量与预期大小相符的大约60 kDa的融合蛋白。利用表达产物作为抗原,对EV71感染病人阳性血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的检测用抗原。 相似文献
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酵母高稳定载体的构建及人-αA干扰素在酵母中的高表达和分泌 总被引:8,自引:0,他引:8
本文利用酿酒酵母天然2μm质粒的SnaBI位点与pEMBL Yi27质粒的SmaI位点经平末端连接,构建成酿酒酵母高稳定质粒载体pHC11,经测定表明,其酵母转化子在非选择培养条件下连续生长50世代后,仍有82%的细胞保留该质粒,此结果证实了2μm质粒中非功能区的存在,将人-αA干扰素基因表达分泌单元插入pHC11,构建成重组质粒转化酵母后,在完全培养基中发酵培养,经分析测定,培养上清液中表达产物占总蛋白量的36.8%,干扰素效价达2.6×10~(10)u/L,表明利用高稳定载体pHC11使人-αA干扰素在酵母中得到了高表达和分泌。 相似文献