激光光镊拉曼光谱技术在生物医学上的应用及进展

激光光镊拉曼光谱技术(LTRS)是一种将激光光镊与共聚焦拉曼光谱技术相结合的产物。该技术能够保证在生理条件下捕获、操控、测量在悬浮状态下单个活性细胞并对其进行生物学分析研究。这种在单细胞研究上的独特优势使其越来越受到人们的关注。本文以激光光镊拉曼光谱技术在生物医学上的应用及其技术发展历程为主线,围绕拉曼光谱技术在细胞分选及细胞的特性研究,多光镊拉曼光谱系统,微流控传输系统,多模式分析系统四个方面综述了近些年来光镊拉曼光谱技术如何通过其他技术联用及其技术的改进实现在多数据采集与整合,高效率,高通量和自动化的传输方面的发展,并概述了LTRS技术生物医学上的应用。最后,对其未来的发展前景进行展望。     

单个大鼠胎肝干细胞的激光光镊喇曼光谱

激光光镊喇曼光谱系统是将激光光镊与喇曼光谱相结合的一项光学技术,可以在接近自然的生理状态下研究单个生物细胞的识别及其构成成分的检测.本文采用胶原酶消化法,分离10~21天不同孕期大鼠的胎肝干细胞和成体大鼠的肝实质细胞,应用激光光镊喇曼光谱技术检测分离到单个胎肝干细胞和肝实质细胞,以及WB-F344大鼠肝干细胞系细胞,并比较了胎肝干细胞和肝实质细胞的喇曼光谱.结果发现,13天以前孕大鼠胎肝干细胞在1 336cm-1(代表多聚核苷酸链(嘌呤))和1 446cm-1(代表蛋白的弯曲模型)处的峰依次增高,13天孕大鼠胎肝干细胞在1 336cm-1和1 446cm-1处的平均峰值最高,14天以后逐渐降低.结果表明激光光镊喇曼光谱系统可以鉴别不同孕期的胎肝细胞和成体肝实质细胞,分析胎肝干细胞的分化机理,为临床应用肝干细胞治疗奠立基础.     

光镊捕获金福菇孢子的拉曼光谱分析

使用光镊拉曼光谱系统俘获悬浮在生理盐水中的单个金福菇孢子,激发并收集其拉曼信号,结果显示单个金福菇孢子的拉曼光谱基本能呈现其内含物的组成和结构信息,脂类物质是其主要成分。同种栽培方式的3个不同菌株单个金福菇孢子的平均拉曼光谱信号基本一致,分别对其进行多元统计分析(PCA),无法区分其拉曼光谱信号;同一菌株不同栽培方式的单个孢子平均拉曼光谱的差异光谱表明其主要成分相同,都以脂类物质为主;而源自于脂类1743、1655、1442、1125、1080、1070、876、728cm-1等峰的信号强度基本一致,说明其脂类的含量基本相同。从单细胞拉曼光谱角度初步分析金福菇孢子,为光镊拉曼光谱技术研究食用菌孢子萌发机理提供有意义的参考。     

乙醇胁迫酵母凋亡过程的单细胞喇曼光谱

在群体细胞水平和单个酵母细胞水平上,应用光镊喇曼光谱技术对高浓度乙醇胁迫过程中细胞内生物大分子物质的动态变化进行实时监测.基于两种水平上的研究结果显示:在高浓度乙醇胁迫下,归属于核酸的喇曼峰(721,1 083,1 301cm-1)、归属于蛋白质的喇曼峰(721,858,1 001,1 301,1 445,1 608,1 657cm-1)和归属于脂类(1 083,1 301,1 445cm-1)喇曼峰的峰强度都随处理时间的延长而显著降低,说明了高浓度乙醇诱导酵母凋亡过程中核酸、蛋白质、脂类等物质的含量是逐渐降低的.结合单因素分析法与重复测量分析法发现,群体细胞与单个细胞光谱的变化有明显差异性,反映基于群体细胞的研究,个体细胞的信息被平均光谱信息所掩盖,无法体现个体间所存在的差异.应用激光镊子喇曼光谱技术基于单个细胞水平上的研究能更直接、真实地反映高浓度乙醇胁迫下细胞内生物大分子变化的动态信息.     

单细胞拉曼光谱研究游离脂肪酸对NIT-1胰岛β细胞生理的影响

运用激光镊子拉曼光谱技术探讨高浓度游离脂肪酸对NIT-1胰岛β细胞生理的影响。实验组细胞以含0.25mmol/L棕榈酸培养12,24,48h,平行对照组中不含任何脂肪酸。通过扫描形式收集各组细胞的拉曼光谱后,使用Hoechs33342/PI荧光染色保留活细胞的光谱,并在OriginPro 8.0系统中比较各组平均光谱的差异。结果显示对照组间的拉曼光谱无明显差异;高脂组光谱在780、1124、1092cm-1及1172cm-1发生拉曼位移,且780、1172、855cm-1及873cm-1峰值强度降低。这些变化的光谱峰在分子归属上指认为细胞内DNA和蛋白质。由此推断高浓度游离脂肪诱导NIT-1细胞损伤在光谱表现为细胞内DNA及蛋白质的结构、含量改变,且该变化与细胞的凋亡有着密切联系。在实验中激光光镊拉曼系统对观察细胞早期损伤有着积极作用。     

应用光镊子拉曼光谱鉴别阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的研究

应用激光镊子拉曼光谱技术比较分析阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的拉曼吸收峰,寻找具有分类学鉴别价值的特征拉曼峰。通过光镊随机俘获单个大小一致、有活力的虫体,记录其拉曼光谱,收集数据并做主成分分析。在937cm-1、1002cm-1和1446cm-1谱峰的强度和谱型上有差异,根据1002cm-1峰的信号强度,并结合937cm-1和1002cm-1峰强度比值(I937/I1002)以及1002cm-1和1446cm-1峰强度比值(I1002/I1446)可以作为区分阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的量化指标。该法是简便、快捷、有效地鉴别两种人体毛滴虫的新方法。     

子宫病变组织的拉曼光谱研究

拉曼光谱方法可以从分子水平反映组织、细胞在化学成分及分子结构上的差异,现已在细胞、组织的结构、功能及病变等方面的研究工作中取得了重大进展.文章首次利用光纤拉曼光谱仪研究了子宫肌瘤、子宫内膜癌、子宫腺肌症等子宫病变组织的拉曼光谱,并与对应正常组织的拉曼光谱进行了比较.结果表明:子宫肌瘤组织中甲硫氨酸C-S键振动引起的拉曼峰分裂成为双峰,包括一个由色氨酸振动引起的峰,并出现了一个胡萝卜素引起拉曼峰,这在正常肌层组织中没有体现出来,子宫内膜癌组织在1 447 cm-1处对应着CH2-CH3的变形振动,表现出组织癌变的特征峰;子宫腺肌症组织在骨架α螺旋C-C键的伸缩振动引起的拉曼峰强度明显弱于正常组织,其由C-O键弯曲振动引起的拉曼峰由正常组织的1 160 cm-1移至1 173 cm-1.以上结果进一步证实了拉曼光谱技术能在分子水平有效鉴别不同的子宫病变,这不仅有助于子宫病变的早期诊断,同时,对子宫疾病的基础研究也是至关重要的.而基于光纤的拉曼光谱技术将有望发展成一种高灵敏的诊断技术.     

结直肠组织中脂类的拉曼光谱研究

利用共聚焦显微拉曼光谱系统,检测了结直肠癌组织及邻近正常组织的拉曼光谱234例,从分子水平探讨结直肠癌变的原因。实验结果表明：在900～2 100 cm-1频移范围内,与正常组织比较,归属于结直肠癌组织中脂类伸缩振动的1 067和1 133 cm-1 拉曼峰强度相对较弱,扭转振动的1 299 cm-1与CH面内变形振动的1 264 cm-1拉曼峰的强度比值减少,应用SPSS16.0统计学软件进行平均值计算与比较,正常组织中的1 299和1 264 cm-1的强度比值平均值为3.17,癌变组织的为1.33; 二者的分界值为1.96,以此判别结直肠癌组织和正常组织符合率为94%。研究表明,结直肠癌组织中脂类的链内纵向有序性下降,不饱和度增加。可推测结直肠癌组织中脂类的能量储存增加是引起这些变化的原因,而这些变化将导致细胞膜的流动性增强,从而改变细胞膜的物质运输、能量传递和信号传导,终将引起DNA 结构的变化。因此,脂类的能量分布变化可能是导致细胞癌变的原因之一。     

一种与光镊结合的显微拉曼光谱技术

论述了一种与光镊结合的显微拉曼光谱即"光镊-显微拉曼光谱"系统的构建方案。给出了利用该系统测得的活细胞(大白鼠血细胞,酵母细胞)的微区拉曼光谱,并将红外光镊束缚下的Ar+激光激发的血细胞的拉曼光谱,与用单一Ar+激光光镊束缚并同时激发的血细胞拉曼光谱,以及血细胞直接贴在基底上的拉曼光谱进行了分析对比。实验表明,前者比后两种实验方案的血细胞拉曼光谱信号有显著提高。分析了红外1064 nm光镊激光和可见514.5 nm Ar+激光对活细胞的损伤效应,发现高功率的红外激光对细胞的损伤作用远小于低功率的Ar+激光。并将该系统应用于碳纳米管材料分析,获得了单壁碳纳米管的拉曼光谱。     

拉曼光谱测定单个细菌芽孢吡啶二羧酸浓度及机理研究

应用激光镊子拉曼光谱技术(LTRS)测定19株芽孢杆菌的单个细菌芽孢吡啶二羧酸(DPA)浓度,并验证了系统的重现性。一束30 mW,785 nm的近红外激光导入倒置显微镜,形成光镊,随机俘获水溶液中的单个芽孢,同时收集其拉曼光谱信号。细菌芽孢的DPA是以与钙离子形成的鳌合物(Ca-DPA)形式存在,收集到的芽孢拉曼光谱信号反映的是Ca-DPA信息,选用信号最强、与Ca-DPA浓度成线性关系的1 017 cm-1作为其定量的谱峰。通过1 017 cm-1的峰强,推算出Ca-DPA的浓度。结果显示,单个芽孢的拉曼光谱能够很好地反映出单个芽孢的特征信息,不同种、同种不同菌株之间的芽孢的DPA浓度有所不同,同一菌株的不同芽孢个体之间DPA浓度也存在差异。该方法不需要复杂的分离、纯化过程,可在水溶液中直接俘获单个芽孢并收集其拉曼光谱信号,便可得到单个芽孢的信息,读出DPA的浓度水平。     

单细胞拉曼光谱结合多元统计方法分析不同酿酒酵母菌株的成分差异

应用单细胞拉曼光谱技术结合多元统计方法分析比较了六株不同来源的酿酒酵母菌株的同步化细胞,从而获知菌株间细胞成分的差异.利用连续密度梯度离心法分离酿酒酵母同步化细胞,分别对六个酵母菌株的同步化单细胞进行拉曼信号收集,并结合主成分分析(PCA)、辨别函数分析(DFA)两种多元统计分析光谱差异.结果表明,细胞的拉曼光谱表征其...     

Near-infrared Raman spectroscopy of single optically trapped biological cells

We report on the development and testing of a compact laser tweezers Raman spectroscopy (LTRS) system. The system combines optical trapping and near-infrared Raman spectroscopy for manipulation and identification of single biological cells in solution. A low-power diode laser at 785 nm was used for both trapping and excitation for Raman spectroscopy of the suspended microscopic particles. The design of the LTRS system provides high sensitivity and permits real-time spectroscopic measurements of the biological sample. The system was calibrated by use of polystyrene microbeads and tested on living blood cells and on both living and dead yeast cells. As expected, different images and Raman spectra were observed for the different cells. The LTRS system may provide a valuable tool for the study of fundamental cellular processes and the diagnosis of cellular disorders.     

单个鼻咽癌细胞的拉曼光谱分析的研究

利用激光镊子拉曼光谱系统研究了鼻咽癌细胞株和正常人鼻咽部气道上皮细胞株的单个细胞的拉曼光谱,对于每个细胞在不同部位测3个点。结果显示：正常细胞和癌细胞的平均拉曼光谱有显著差异：正常的细胞光谱强度比癌细胞的明显要高;正常细胞的1304和1336 cm-1处峰的强度比值为1.05,癌细胞的为1.22。用PCA主成分分析和DFA判别分析分别对单个细胞的平均光谱和不同位置所取得的单独光谱进行分析,结果发现：PCA和DFA均可以把癌细胞和正常细胞正确区分,对于单独光谱,DFA的效果更好一些。同时还发现同一个细胞中不同的光谱位置对PCA和DFA的区分度影响不是很大;PCA和DFA的图中还表明癌细胞的均匀度要比正常细胞的差。以上的研究均表明：激光镊子拉曼光谱可以成为区别正常鼻咽细胞和鼻咽癌细胞的有效手段。     

单个血小板的拉曼光谱分析

利用波长为785 nm的激光束构建光镊拉曼光谱系统,俘获悬浮在生理盐水中的人和三种动物(家猪、大鼠、家兔)的单个血小板,激发并收集其拉曼光谱。单个血小板的平均拉曼光谱信号清楚地反映了血小板的生化组成特点,人血小板的拉曼光谱与三种动物的明显不同,1 524 cm-1是人类血小板所特有的拉曼信号峰,而1 157 cm-1在人类中显著高于三种动物的,人类血小板的平均I_{1 157}/ I_{1 003}为0.795,而家猪、大鼠、家兔的分别为0.532,0.502,0.485。多元统计分析结果显示,不同物种血小板的拉曼信号落入不同的空间,可以判别区分。上述结果表明,单个血小板的拉曼光谱基本反映了血小板的主要组成成分,结合多元统计分析可以用于辨别不同的物种的血小板,光镊拉曼光谱系统是实时研究细胞生理、生化变化的快速简便而有效的工具。     

浓醪乙醇发酵的单细胞拉曼光谱表征

应用激光镊子拉曼光谱技术收集500L发酵罐中木薯淀粉浓醪乙醇发酵过程底物、产物及酵母单细胞的拉曼光谱,以期从单细胞水平为乙醇发酵提供新的认识。结果显示:1)拉曼光谱可以实时监测浓醪乙醇发酵过程底物与产物的变化;2)酵母细胞胞内物质的变化存在类似于产物变化的前发酵期、主发酵期和后发酵期3个阶段,但出现的时间要比产物变化晚约4h;3)为适应浓醪发酵环境,酵母细胞的生理状态和胞内物质在不断地进行调整,随着环境乙醇浓度的升高,酵母细胞在胞内累积蛋白质和脂类物质,蛋白质二级结构逐渐变为以无规则卷曲为主;4)发酵后期,酵母细胞在胞内累积大量的嘌呤类物质,但细胞间含量存在异质性。上述结果表明,单细胞拉曼光谱技术提供了一种研究微生物发酵的新方法,可从新的角度获知乙醇发酵过程酵母细胞内外的变化信息。     

Raman sorting and identification of single living micro-organisms with optical tweezers

We report on a novel technique for sorting and identification of single biological cells and food-borne bacteria based on laser tweezers and Raman spectroscopy (LTRS). With this technique, biological cells of different physiological states in a sample chamber were identified by their Raman spectral signatures and then they were selectively manipulated into a clean collection chamber with optical tweezers through a microchannel. As an example, we sorted the live and dead yeast cells into the collection chamber and validated this with a standard staining technique. We also demonstrated that bacteria existing in spoiled foods could be discriminated from a variety of food particles based on their characteristic Raman spectra and then isolated with laser manipulation. This label-free LTRS sorting technique may find broad applications in microbiology and rapid examination of food-borne diseases.     

Multiple-trap laser tweezers Raman spectroscopy for simultaneous monitoring of the biological dynamics of multiple individual cells

We report the development of a multiple-trap laser tweezers Raman spectroscopy (LTRS) array for simultaneously acquiring Raman spectra of individual cells in physiological environments. This LTRS-array technique was also combined with phase contrast and fluorescence microscopy, allowing measurement of Raman spectra, refractility, and fluorescence images of individual cells with a temporal resolution of ~5 s. As a demonstration, we used this technique to monitor multiple Bacillus cereus spores germinating in a nutrient medium for up to 90min and observed the kinetics of dipicolinic acid release and uptake of nucleic acid-binding stain molecules during spore germination.     

激光镊子拉曼光谱法优化红法夫酵母合成虾青素条件

用激光镊子拉曼光谱法优化红法夫酵母生产虾青素的条件。首先,将红法夫酵母细胞拉曼光谱与虾青素标准品溶液拉曼光谱进行对比,找出定量虾青素的拉曼特征峰;然后对照红法夫酵母生长曲线与不同时间点红法夫酵母细胞内虾青素含量曲线,进行发酵时间的优化;最后将红法夫酵母分别用不同氮源、碳源培养基培养,对比其细胞的虾青素拉曼特征峰强度,最终优化培养基。由实验可得,适宜定量虾青素的拉曼特征峰是1520cm-1峰;最佳发酵时间为72h;最佳优化培养基氮源含硫酸铵4g/L+硝酸钾4g/L,碳源含蔗糖60g/L。从上述结果可知,用激光镊子拉曼光谱法对红法夫酵母合成虾青素的条件进行优化,充分发挥了其操作简便、耗时短、样品用量少、对样品无损伤等优势,使所得结果更准确可信。因此,激光镊子拉曼光谱法是红法夫酵母细胞合成虾青素条件优化的理想选择。