基于孔道突变的钙库控制钙离子通道的门控机制研究

钙释放激活的钙通道(CRAC)是非兴奋性细胞中钙离子内流的主要途径. 然而,CRAC激活过程受到多种因素的调控,研究的主要困难在于该通道蛋白的孔结构Orai及其激活蛋白STIM复合体的结构复杂,难以在原子尺度上通过实验观察到完整的激活及失活过程. 电生理和生化实验表明,与野生型Orai孔道的开启需要STIM蛋白激活不同,Orai蛋白上某些氨基酸的突变会导致其变成自发开启的状态. 因此,研究者普遍使用处于自发开启状态的通道突变体,通过研究突变体的结构和电生理性质,推测野生型孔道在生理条件下可能的激活机制,并提出了不同的调控机制模型(Biopolymers 111,e23392 (2020)). 然而,突变体是否可以真实地反映CRAC通道的激活机理还存在一些不确定性. 本文采用微秒级分子动力学模拟,结合自由能计算和基于电扩散连续模型的有限元分析,系统性地探索了三种处于激活状态的dOrai突变体(G170P、H206A和P288A)的结构及动态变化、离子通过自由能及电流电压曲线,并与以往工作中对于其它突变体(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110,17332 (2013);J. Phys. Chem. B 118,9668 (2014))以及野生型处于开启状态的一种可能的结构模型(iScience 16,356 (2019))进行比较. 计算结果表明,三种突变体的孔道结构均呈现出扩张的趋势,孔道内水分子的有序排布程度降低,从而显著降低了阳离子在孔道内扩散的自由能. 但不同的dOrai突变体采用了不同的模式来保持其通道处于激活状态. 具体的说,G170P突变体通过引入脯氨酸使直接形成孔道的跨膜螺旋TM1发生显著弯曲,从而有效增大孔径. H206A和P288A突变体都是通过别构效应间接地改变孔道结构：其中H206A 通过在TM1外侧的跨膜螺旋TM2上引入侧链较小的丙氨酸而破坏同一条链上TM1和TM2间的堆积作用,引起TM1的扩张;而P288A的突变位点处于孔道蛋白最外侧的跨膜螺旋TM4上,减小TM4的弯曲程度,并进一步将构象变化传递到孔道中心的TM1,从而使得孔径增大而激活通道. 因此,虽然三个突变体均可以导致Orai孔道的自发激活,但突变位点各不相同,导致构象变化的分子机制也各有差异. 此外,与野生型dOrai通道处于激活状态的结构模型相比,上述突变体的孔道结构、整流性质和阳离子选择性都有明显差异. 因此,对于突变体的研究可以为理解Orai 通道的激活机制提供信息,但并不能真实地反映生理条件下由激活蛋白STIM调控的Orai通道的门控过程.     

Cys对近红外荧光蛋白PAiRFP1光谱学行为的影响研究

PAiRFP1是一种以细菌光敏色素为模板,改造得到的光激活荧光蛋白。与其他光激活荧光蛋白相比,它最大的优势是激发、发射都在近红外区域。本论文围绕该蛋白中含有的8个半胱氨酸残基,开展了定点突变、光谱学检测等工作,发现(1)在8个单突变体中,仅有Cys-29突变改善了光激活蛋白的分子亮度,其它突变都削弱了近红外荧光;(2)伴随着环境氧化、还原条件的改变,C29S突变近红外荧光显著降低,这说明该位点的半胱氨酸残基对于维持该近红外荧光蛋白在氧化还原环境中的稳定性具有重要作用,相关机理尚待深入研究。     

甘氨脱氧胆酸钠胶束对Ca~(2+)离子的“缓冲”作用及其机理

采用浊度滴定、激光光散射谱、透射电子显微镜和傅里叶变换红外光谱等方法研究了甘氨脱氧胆酸钠(NaGDC)胶束对Ca2+的"缓冲"作用及其机理。结果表明,NaGDC浓度在CMC以上时,将延缓甘氨脱氧胆酸钙盐的沉淀,浓度越高"缓冲"能力越大。可能的作用机理是当NaGDC浓度小于CMC时,Ca2+直接与GDC-离子作用,形成甘氨脱氧胆酸钙沉淀;当NaGDC浓度大于CMC时,首先,Ca2+与NaGDC胶束亲水面上的羧基作用,使NaGDC小胶束通过Ca2+桥连接形成纤维状的大胶束。而后,随着Ca2+浓度的增加,纤维状胶束中与Ca2+作用的COO-逐渐增多,当胶束中Ca2+/Na+比增大到一定值时,最终形成NanCam(GDC)n+2m沉淀,从而延缓了甘氨脱氧胆酸钙盐的生成。为研究胆汁中表面活性与金属离子的复杂相互作用给出了新思路。     

光谱法和分子对接模拟技术研究托拉塞米与胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用

托拉塞米(TOR)属于吡啶磺酰脲类袢利尿剂,被广泛有效地用于高血压,心脏衰竭,慢性肾功能衰竭和肝脏疾病的治疗。TOR在治疗过程中易引起的不良反应之一为轻微肠胃不适。然而,TOR与消化蛋白酶(胰蛋白酶和胃蛋白酶)分子间的相互作用鲜有报道。在模拟生理条件下,采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱和分子对接技术研究了不同温度下托拉塞米(Torasemide, TOR)与胃蛋白酶(Pepsin)和胰蛋白酶(Trypsin)间的相互作用。所有荧光数据均进行了内滤光校正以获得更准确的结合参数。结果表明,TOR-Pepsin和TOR-Trypsin体系的猝灭常数(K_SV)均与温度呈负相关,说明TOR与Pepsin及Trypsin之间的作用机制均为静态荧光猝灭。利用紫外-可见吸收光谱、同步荧光光谱、3D荧光光谱和圆二色光谱法考查了TOR对Trypsin和Pepsin构象的影响。结果发现胃蛋白酶或胰蛋白酶中酪氨酸残基的极性改变较色氨基更明显,TOR可改变色氨酸残基的微环境并降低Trypsin和Pepsin中β-折叠结构,进而可能影响其生理功能。分子对接结果表明,TOR与Pepsin的结合位点位于由Asp-32和Asp-215组成的活性中心周围,从而抑制Pepsin活性。而TOR通过疏水作用力结合在Trypsin的口袋型底物结合位点(S1口袋),促进底物进入酶活性中心,最终表现为Trypsin活性升高。该研究探讨了TOR与胃蛋白酶和胰蛋白酶的结合作用和毒性机制,为TOR的安全使用提供重要依据。     

光谱法和分子对接模拟技术研究托拉塞米与胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用（英文）

托拉塞米(TOR)属于吡啶磺酰脲类袢利尿剂,被广泛有效地用于高血压,心脏衰竭,慢性肾功能衰竭和肝脏疾病的治疗。TOR在治疗过程中易引起的不良反应之一为轻微肠胃不适。然而,TOR与消化蛋白酶(胰蛋白酶和胃蛋白酶)分子间的相互作用鲜有报道。在模拟生理条件下,采用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱和分子对接技术研究了不同温度下托拉塞米(Torasemide,TOR)与胃蛋白酶(Pepsin)和胰蛋白酶(Trypsin)间的相互作用。所有荧光数据均进行了内滤光校正以获得更准确的结合参数。结果表明,TOR-Pepsin和TOR-Trypsin体系的猝灭常数(KSV)均与温度呈负相关,说明TOR与Pepsin及Trypsin之间的作用机制均为静态荧光猝灭。利用紫外-可见吸收光谱、同步荧光光谱、3D荧光光谱和圆二色光谱法考查了TOR对Trypsin和Pepsin构象的影响。结果发现胃蛋白酶或胰蛋白酶中酪氨酸残基的极性改变较色氨基更明显,TOR可改变色氨酸残基的微环境并降低Trypsin和Pepsin中β-折叠结构,进而可能影响其生理功能。分子对接结果表明,TOR与Pepsin的结合位点位于由Asp-32和Asp-215组成的活性中心周围,从而抑制Pepsin活性。而TOR通过疏水作用力结合在Trypsin的口袋型底物结合位点(S1口袋),促进底物进入酶活性中心,最终表现为Trypsin活性升高。该研究探讨了TOR与胃蛋白酶和胰蛋白酶的结合作用和毒性机制,为TOR的安全使用提供重要依据。     

利用内禀荧光探针研究蛋白相互作用中硫氧还蛋白的氧化还原态

细胞内蛋白质的氧化还原状态直接影响细胞的增殖、分化及凋亡,而氧化还原状态的改变对调控细胞的生存或死亡尤为重要。硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX)是一种广泛存在于生物体内的氧化还原调节蛋白,其在细胞内氧化还原状态的变化是发挥其氧化还原调控作用的重要过程。以TRX为对象并以其中的色氨酸残基(Trp)作为内禀荧光探针,利用蛋白质定点突变、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、荧光光谱和圆二色谱等技术和方法,研究TRX与谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX3)相互作用过程中氧化还原态的变化。通过观测TRX以及突变体中色氨酸荧光光谱的变化,研究蛋白相互作用的电子转移模式以及TRX氧化态-还原态之间的相互转化。结果表明氧化态的TRX与还原态的GPX3之间存在相互作用并发生电子交换,解释了二者之间电子传递模式为GPX3将电子传递给TRX,为揭示TRX在细胞信号传递过程中的物理化学机制提供了实验依据。     

PDI抑制α-synuclein纤维化聚集作用机制研究

天然无结构蛋白?-synuclein在帕金森症(PD)患者脑部的路易小体中异常聚集,被认为是引起PD的重要原因之一,但是目前关于?-synuclein的聚集机制仍没有定论.蛋白质二硫键异构酶(PDI)是细胞内质网中重要的分子伴侣蛋白,能够阻止内质网中无结构蛋白的聚集.在PD患者的脑细胞内发现PDI过量表达,且酶活性位点半胱氨酸被亚硝基化使其活性受到抑制.体外实验证明,PDI能够抑制?-synuclein的聚集,但其具体的分子机制还不清楚,研究PDI抑制?-synuclein聚集的具体机制可能对于PD治疗有重要意义.该文利用核磁共振(NMR)方法研究了?-synuclein与PDI的相互作用,发现?-synuclein与PDI的结合位点位于?-synuclein的N端;将PDI所有的6个半胱氨酸突变成丝氨酸,得到突变体PDI C-S,发现?-synuclein与PDI C-S的结合位点则位于其C末端;荧光实验结果表明突变体PDI C-S对?-synuclein纤维化聚集的抑制作用减弱,说明PDI抑制?-synuclein的纤维化聚集主要是通过与?-synuclein的N端残基结合来实现的.     

GB1与金属离子相互作用的NMR研究

G群链球菌G蛋白的B1结构域——GB1蛋白,常被用作发展体外及体内基于顺磁核磁共振（NMR）的蛋白质结构测定方法的研究模型.为确保赝接触化学位移（PCS）、顺磁弛豫增强（PRE）等顺磁约束数据的准确性,了解GB1和金属离子,尤其是顺磁离子的相互作用非常必要.然而GB1和二价金属离子以及镧系金属离子的相互作用并不十分清楚.本文利用NMR波谱研究了GB1和镧系金属离子以及多种二价金属离子的相互作用.我们发现GB1和镧系金属离子之间存在弱特异性相互作用,和Mn²⁺、Cu²⁺以及Co²⁺等顺磁二价离子弱结合,但不与Ca²⁺、Mg²⁺以及Zn²⁺等抗磁二价离子结合.该研究表明在GB1上链接顺磁探针时,应使用与固有位点结合常数差异明显的顺磁标签以获取正确的PRE数据.     

Cr(Ⅵ)与细胞色素c相互作用的研究

运用荧光光谱、圆二色(CD)谱法研究了K2Cr2O7与细胞色素c的相互作用。结果表明,Cr(Ⅵ)酸根离子与细胞色素c相互作用引起细胞色素c的α-螺旋含量降低,使酪氨酸残基所处微环境的极性增加,色氨酸残基的疏水性增加。Cr(Ⅵ)与细胞色素c的作用位点更接近于色氨酸残基,引起色氨酸残基的微环境变化的程度要大于酪氨酸残基。     

The concentration quenching and crystallographic sites of Eu²⁺ in Ca₂BO₃Cl

A yellow phosphor, Ca2BO3 Cl:Eu2+ , is prepared by the high-temperature solid-state method. Under the condition of excitation sources ranging from ultraviolet to visible light, efficient yellow emission can be observed. The emission spectrum shows an asymmetrical single intensive band centred at 573 nm, which corresponds to the 4f 6 5d 1 →4f 7 transition of Eu2+ . Eu2+ ions occupy two types of Ca2+ sites in the Ca2BO3 Cl lattice and form two corresponding emission centres, respectively, which lead to the asymmetrical emission of Eu2+ in Ca2 BO 3 Cl. The emission intensity of Eu2+ in Ca2BO3 Cl is influenced by the Eu2+ doping concentration. Concentration quenching is discovered, and its mechanism is verified to be a dipole–dipole interaction. The value of the critical transfer distance is calculated to be 2.166 nm, which is in good agreement with the 2.120 nm value derived from the experimental data.     

Ca2+掺杂铌酸锶钡晶体的光折射变化特性研究

基于Ca2+掺杂铌酸锶钡晶体的透射特性,探讨了Ca2+在晶体中的电子行为机制,分析了Ca2+掺杂而引起的光致折射率变化特性.采用Michelson干涉装置测得了样品折射率随时间变化的特性曲线.实验结果分析表明,适当的ca2+掺杂可以有效改善铌酸锶钡晶体的光折射特性.     

用于白光LED的单一基质白光荧光粉Ca2SiO3Cl2:Eu2+,Mn2+的发光性质

用高温固相法合成了Eu2+,Mn2+共激活的Ca2SiO3Cl2高亮度白色发光材料,并对其发光性质进行了研究.该荧光粉在近紫外光激发下发出强的白色荧光,Eu2+中心形成峰值为419 nm和498 nm的特征宽带,通过Eu2+中心向Mn2+中心的能量传递导致了峰值为578 nm的发射,三个谱带叠加从而在单一基质中得到了白光.激发光谱均分布在250-415 nm的波长范围,红绿蓝三个发射带的激发谱峰值分别位于385 nm,412 nm,370 nm和396 nm处,可以被InGaN管芯产生的紫外辐射有效激发.Ca2SiO3Cl2:Eu2+,Mn2+是一种很有前途的单一基质白光LED荧光粉.     

Ca3SiO5:Eu2+材料光谱特性研究

采用溶胶一凝胶法制备了Ca3SiO5:Eu2+发光材料.测量了材料的激发与发射光谱,结果显示,材料的发射光谱为一峰值位于505 nm处的不对称的宽带谱;监测505nm发射峰,所得材料的激发光谱为一双峰宽谱,峰值为374和397nm,研究了合成条件对Ca3SiO5:Eu2+材料发射光谱的影响,结果显示,随合成温度或合成时间或Eu2+浓度的增大,Ca3 siO5:Eu2+材料发射光谱峰值强度均表现出先增大后减小的趋势,当合成温度为1100℃、合成时间为4 h、Eu2+浓度为0.5 mol%时,Ca3SiO5:Eu2+材料发射光谱峰值强度最大.     

Eu2+激活的Ca3SiO5绿色荧光粉的制备和发光特性研究

研究了Eu2+激活的绿色发光材料Ca3SiO5的制备条件和发光性质. Eu2+中心形成主峰值为501 nm和次峰值为570 nm的特征宽带,两峰值叠加形成发射峰值为502 nm的绿色发射光谱带. 利用这些光谱结果和Van Uitert 经验公式,确认Ca3SiO5:Eu2+中存在两种性质有差异的Eu2+发光中心,它们分别占据基质中八配位的Ca2+(Ⅰ)格位和四配位的Ca2+(Ⅱ)格位. 其激发光谱分布在250-450 nm的波长范围,峰值位于375 nm处,可以被InGaN管芯产生的350-410 nm辐射有效激发.     

Dual mechanisms of Bcl-2 regulation in IP3-receptor-mediated Ca2+ release: A computational study

Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP₃R)-mediated calcium ion (Ca²⁺) release plays a central role in the regulation of cell survival and death. Bcl-2 limits the Ca²⁺ release function of the IP₃R through a direct or indirect mechanism. However, the two mechanisms are overwhelmingly complex and not completely understood. Here, we convert the mechanisms into a set of ordinary differential equations. We firstly simulate the time evolution of Ca²⁺ concentration under two different levels of Bcl-2 for the direct and indirect mechanism models and compare them with experimental results available in the literature. Secondly, we employ one- and two-parameter bifurcation analysis to demonstrate that Bcl-2 can suppress Ca²⁺ signal from a global point of view both in the direct and indirect mechanism models. We then use mathematical analysis to clarify that the indirect mechanism is more efficient than the direct mechanism in repressing Ca²⁺ signal. Lastly, we predict that the two mechanisms restrict Ca²⁺ signal synergistically. Together, our study provides theoretical insights into Bcl-2 regulation in IP₃R-mediated Ca²⁺ release, which may be instrumental for the successful development of therapies to target Bcl-2 for cancer treatment.     

新型罗丹明酰胺杯芳烃-Sb~(3+)配合物探针对钙离子的响应

合成了一种罗丹明B酰胺-氧杂杯芳烃衍生物1。在以Tris-HCl作为缓冲体系的乙腈溶液(pH7.0)中,化合物1本身无色且无荧光,加入Sb3+后,1的螺环结构打开,观察到显著的荧光增强和颜色变红。再加入Ca2+则导致1-Sb3+配合物的荧光猝灭及红色消失。在此条件下,其他共存离子没有明显响应。因此1-Sb3+配合物可作为检测Ca2+的超分子荧光和比色化学传感器。     

钙(Ⅱ)增敏秦皮乙素-CTMAB体系荧光特性的研究

研究了钙 ( ) -秦皮乙素 - CTMAB体系的荧光性质 ,发现 Ca2 +对秦皮乙素 - CTMAB有较强的增敏作用 ,建立了荧光光谱法测定痕量秦皮乙素的新方法。其线性范围为 2 .38× 10 -8— 2 .38× 10 -6mol· L-1;检出限为 1.2× 10 -8mol·L-1;回收率为 91.39%— 10 2 .31% ;相对标准偏差为 3.6 %。     

Eu2+在Ba2Ca(BO3)2中的发光特性及浓度猝灭

采用高温固相法,以CaCO₃ (A.R)、BaCO₃ (A.R)、H₃BO₃ (A.R)和Eu₂O₃ (99.99%)为原料制备了Ba₂Ca(BO₃)₂∶Eu²⁺绿色发光材料,测量了材料的晶体结构、发光特性及色坐标等。Ba₂Ca(BO₃)₂∶Eu²⁺材料的激发光谱覆盖200~500 nm的紫外-可见光区。在400 nm近紫外光激发下,材料的发射光谱为一主峰位于537 nm的非对称宽谱,对应于Eu²⁺的4f⁶5d¹→4f⁷特征跃迁。研究发现,随Eu²⁺掺杂浓度的增大,Ba₂Ca-(BO₃)₂∶Eu²⁺材料的发射强度呈现先增大、后减小的变化趋势,最大发射强度对应的Eu²⁺掺杂摩尔分数为2%。造成发射强度下降的原因为浓度猝灭,其机理为电偶极-电偶极相互作用。依据晶格常数及实验光谱数据,得出临界距离R_c分别为2.64 nm和2.11 nm。随Eu²⁺掺杂浓度的增大,Ba₂Ca(BO₃)₂∶Eu²⁺材料的色坐标变化微小。计算得到Ba₂Ca(BO₃)₂∶2%Eu²⁺的转换效率约为72%。     

γ-Ca_2SiO_4∶Ce~(3+),Al~(3+)荧光粉的合成与发光性能研究

采用高温固相法制备了一系列γ-Ca_2SiO_4∶x Ce~(3+),y Al~(3+)黄色荧光粉,通过X射线衍射仪、扫描电镜、激光粒度仪、荧光光谱仪对荧光粉的结构、形貌和光学性能进行了表征。结果表明,1 200~1 300℃温度下生成β-Ca_2SiO_4,在1 350~1 500℃下生成γ-Ca2SiO_4,Al~(3+)和Ce~(3+)的掺入未改变Ca2SiO_4的结构。在1 450℃下合成的γ-Ca_2SiO_4∶0.5%Ce~(3+),4%Al~(3+)样品的相对发光强度最强。在450 nm激发下,在565 nm处存在一个宽带发射峰,主要源于Ce~(3+)的5d→2F7/2和5d→2F5/2跃迁。荧光粉受热影响较大,在450 nm激发下,样品在475 K时的发光强度降为室温的63%。监控波长为565 nm时,Ce~(3+)的衰减曲线符合单指数衰减规律,荧光寿命为104.2 ns,与其跃迁类型和离子价态基本相符。