抗羟甲芬太尼单克隆抗体和抗羟甲芬太尼独特型抗体的特性研究

本文采用羟甲芬太尼免疫的BALB/c小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1融合,获得分泌抗羟甲芬太尼抗体的单克隆杂交瘤细胞株。该株细胞分泌的抗羟甲芬太尼单克隆抗体与羟甲芬太尼结合的亲合力为3.65±0.59×10~7 l/mol。羟甲芬太尼类似物3-甲基芬太尼、β-羟基芬太尼和芬太尼与抗羟甲芬太尼单克隆抗体有部分交叉反应,而DAGO,纳洛酮和双氢依托啡与抗羟甲芬太尼单克隆抗体无交叉反应。应用纯化的抗羟甲芬太尼单克隆抗体免疫家免,获得高滴度的兔抗羟甲芬太尼独特型抗体。抗羟甲芬太尼独特型抗体与抗羟甲芬太尼单克隆抗体结合反应有剂量关系,并呈可饱和性。抗羟甲芬太尼独特型抗体能竞争抑制抗羟甲芬太尼单克隆抗体与原始抗原羟甲芬太尼的结合反应。受体结合分析表明抗羟甲芬太尼独特型抗体能与放射性配体[~3H]羟甲芬太尼和[~3H]DAGO竞争结合大鼠脑匀浆膜蛋白上的阿片受体。在离体生物检定实验中抗羟甲芬太尼独特型抗体还具有类似羟甲芬太尼样作用,能呈剂量依赖地抑制电场刺激引起的小鼠输精管的收缩。以上结果提示抗羟甲芬太尼独特型抗体能与羟甲芬太尼竞争结合抗羟甲芬太尼单克隆抗体上的同一结合位点,具有羟甲芬太尼的内影像结构,并能与μ阿片受体结合,呈阿片受体激动剂样作用。     

新型Ca2+探针用于5-HT诱导细胞钙动员的机制

采用激光共聚焦技术分别进行了新型Ca²⁺荧光试剂STDIn与Fluo-3对胃底平滑肌细胞的标记及其对胞内游离Ca²⁺浓度变化的响应等特性的研究. 结果表明, 与Fluo-3不同, 新型Ca²⁺荧光试剂STDIn对胞浆Ca²⁺具有靶向性, 是一种真正的胞浆Ca²⁺荧光探针, 对5-羟色胺(5-HT)诱导的胞内游离Ca²⁺浓度变化的响应更灵敏迅速. 应用STDIn对5-HT诱导胃底平滑肌细胞内游离Ca²⁺动员的机制研究发现, L型钙通道拮抗剂Mn9202对5-HT升高[Ca²⁺ ]_i有明显的抑制作用; 使用蛋白激酶(protein kinase C, PKC)抑制剂D-Sphingosine孵育后, 再加入5-HT胞内荧光强度明显升高, 而以磷脂酶(phospholipase C, PLC)抑制剂Compound48/80孵育后, 5-HT则不再引起荧光强度的变化. 表明5-HT通过促进外钙内流和内钙释放使[Ca²⁺ ]_i升高; 在胃底平滑肌5-HT升高[Ca²⁺]_i是通过5-HT₂受体介导的IP₃/Ca²⁺和DG/PKC双信使途径; 5-HT通过L型钙通道促进外钙内流; Mn9202亦能通过拮抗5-HT受体而起到抑制5-HT促胞内钙释放的作用.     

柠檬酸镧诱导HeLa细胞凋亡差异蛋白组学研究

稀土具有多种多样的生物效应,研究表明稀土具有促细胞增殖和诱导细胞凋亡的双重作用．作用效应与稀土的种类,物种、浓度以及细胞的种类有关,表现出类似Hormesis效应的“低促高抑”现象．如陈兴安等学者曾报道稀土化合物既能促进正常细胞的生长又能抑制癌细胞．最近,一种化合物（Gd（III）-texaphyrinl已经进入三期临床实验,用于非小细胞肺癌脑转移的治疗．稀土促进细胞凋亡可能与以下机制有关：通过与肿瘤细胞DNA特异性结合,影响DNA的合成或复制、影响细胞周期促进凋亡、增加细胞内活性氧（ROS）水平,通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡,调节机体免疫机能等．我们前期研究表明,柠檬酸镧对各种癌细胞生长的影响存在浓度依赖性,低浓度无明显作用特征,高浓度抑制癌细胞生长,诱导细胞凋亡;不同肿瘤细胞对稀土的响应不同,宫颈癌HeLa细胞株相对敏感．本文进一步利用差异蛋白质组学方法探讨柠檬酸镧诱导HeLa细胞凋亡的作用机制．双向凝胶电泳（2DE）与基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱（MALDI—TOF／TOF—MS）检测结果显示有14种表达差异明显的蛋白．包括与凋亡和细胞增殖相关蛋白：核仁磷酸化蛋白（NMP）和S100钙结合蛋白（S100－A11）表达上调,线粒体prohibitin蛋白下调;应激和氧化应激相关蛋白：包括热休克蛋白（heat shock 70－kDa protein 9 precursor,HspB8）和超氧化物歧化酶1（SOD1）下调,而NAD依耐的亚甲基四氢叶酸脱氢酶（MTHFD2L）上调;翻译和蛋白降解相关蛋白：包括真核翻译延伸因子2（eFF2）、核糖体蛋白（RPLPO）和钙网蛋白前体变体（calreticulin precursor variant and far upstream element（FUSE）binding protein 1,isoform CRA_b）下调,蛋白酶体proteasome beta 3 subunit上调．蛋白组学的结果提示,[La（cit）2]^3-可能通过线粒体凋亡通路以及调节细胞内氧化应激水平诱导Hela细胞凋亡．进一步用免疫印迹（western blotting）进行验证和检测相关凋亡蛋白,结果显示SOD1、eFF2和Nm23蛋白下调,凋亡相关蛋白caspase-9和PARP激活,促凋亡蛋白Bax表达上升和抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降．另外,柠檬酸镧作用细胞后,细胞线粒体膜电位（△ψM）下降,细胞色素c（cyt-c）释放和H2O2产生增加．线粒体膜通透性改变、膜电位的变化、ROS的生成和促凋亡蛋白的释放是细胞凋亡过程的关键事件．这些结果表明柠檬酸镧通过线粒体凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡,这一结论与既往研究相一致,为柠檬酸稀土配合物的抗癌作用机制提供了基础信息．Ca^2＋超载是引起线粒体损伤的重要因素之一,Ca^2＋也能调节电压依赖阴离子通道活性（VDAC）从而调节线粒体通透性转变孔的开放与关闭．柠檬酸镧能解离出镧离子（La^3＋）,La^3＋具有类钙的性质,这可能是镧作用于线粒体引起凋亡的原因之一．当然,有研究表明这种作用具有两面性,低剂量能促进线粒体PTP孔的开放,高浓度表现为拮抗作用或没有影响．另外,VDAC位于线粒体外膜,对线粒体及细胞功能调节非常重要．本研究结果显示,与对照相比,VADC1的表达没有变化,而VADC2没有检测到,说明VADC的表达在柠檬酸镧诱导的细胞凋亡中可能不是一个关键因素．     

毛细管电泳研究最新亮点

1无机多聚磷酸盐的毛细管凝胶电泳分析多聚磷酸盐是一种由几个至数百个磷酸残基相互聚合形成的线性多聚体,广泛存在于自然界的无机环境和细菌、真菌等低等单细胞生物和高等哺乳动物等生命有机体中。多聚磷酸盐分析是探寻地球生命的化学和生物起源的基本研究内容。传统的多聚磷酸盐分析主要采用凝胶电泳和凝胶染色检测,方法烦琐,耗时长。采用阴离子交换色谱结合电导检测,对磷酸盐聚合度应用范围较窄。多聚磷酸盐的毛细管电泳分析主要采用涂层毛细管和管内填充线性聚丙烯酰胺筛分介质的方法,其在毛细管的重复使用、方法的重现性以及高聚合度多聚磷酸盐的分析中存在不足。Whitesides等用低黏度的聚N,N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)作为毛细管凝胶电泳介质,以对苯二甲酸盐为背景吸收电解质,通过优化背景电解质的pH等手段实现了聚合度可达70的聚磷酸盐的高分辨分离和间接灵敏检测。通过在出口端样品瓶中加入聚乙二醇(PEG)与毛细管内溶液密度平衡,使分离电流稳定,重现性提高。该方法简单、方便,并可拓展用于其他无生色团的生物高分子多聚阴离子混合物(如硫酸多糖、低聚磷酸盐二酯、磷壁酸、透明质酸、磷酸软骨素等)的高分辨分析检测。详见: Anal Chem, 2010, 82: 6838～6846。 2压力辅助的毛细管电泳超快速分析红细胞样品中的腺苷酸组分腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)和腺嘌呤核苷单磷酸(AMP)组成了生物体中的腺苷酸系统,它们在生物体中起重要的生物功能作用。ATP是体内组织和细胞的一切生命活动所需能量的直接来源,生命活动的过程中活细胞内部时刻进行着ATP与ADP的相互转化,同时也伴随着能量的储存和释放。3种腺苷酸还参与蛋白质、脂肪、糖和核苷酸的合成,并具有促使机体细胞的修复和再生、增强细胞代谢活性等作用。应用液相色谱分析3种腺苷酸所需的时间为30～45 min。基于3种腺苷酸具有明显不同的负电荷性质,采用毛细管电泳可对其进行快速的分离分析。Zinellu等在前期短端进样快速分析(Electrophoresis, 2008, 29: 3069)的基础上,创建了电泳过程中同时加压辅助电泳分离的超常规压力/电压技术。他们使用了贝克曼公司配有二极管阵列检测器(DAD)的MDQ CE 系统。分离在20 mmol/L醋酸钠缓冲液（pH 3.8）、30 ℃、 25 kV(120 mA)、反向电压（正极为出口端）条件下进行,电泳分离的同时由进样端（负极）向出口端（正极）施加1.378 kPa (0.2 psi)的压力。为避免ATP的水解,他们还对采用酸沉淀方法提取红细胞中腺苷酸的条件进行了优化。采用此方法,3种腺苷酸可在1.5 min内实现高分辨分析,20个红细胞样品的测定可在60 min内完成。该方法可用于临床实际样品中ATP的准确和高通量的超快速分析。该方法也对开发商用毛细管电泳仪的电泳和压力双功能分离作用提供了新的思路。详见: Electrophoresis, 2010, 31: 2854～2857。 3包埋纳米金的聚阳离子涂层毛细管电泳和硼掺杂金刚石电极电化学检测的尿液生物标志物的电泳分析体液中与疾病相关的生物标志物的发现和分析是近年来生物医学分析检测中的重要内容之一。尿液中香草扁桃酸(VMA)和高香草酸(HVA,儿茶酚胺代谢物)含量及相对比值的分析有助于对疾病发展阶段、肿瘤发展、儿童的神经母细胞瘤的预测。发展尿液和其他生物样品中生物标志物的快速灵敏的分析方法具有重要的临床意义。Luong等提出在色氨酸和其他8种重要的多巴胺和吲哚胺类物质共存时检测3-吲哚硫酸盐(IXS,色氨酸代谢物)、HVA和VMA的毛细管电泳分析检测新方法。通过包埋在聚二烯丙基二甲基氯化铵的纳米金(27 nm)对毛细管内壁的涂层修饰,形成稳定的内壁涂层。该涂层使电渗流反向,使IXS、HVA和VMA快速迁移,而其他内源性化合物抗坏血酸、尿酸、儿茶酚胺和吲哚胺的迁移滞后。该涂层的性质稳定,提高了上述多种分析物分离的分辨率。此外,该毛细管电泳分析中使用热丝化学气相沉积构建的硼掺杂金刚石电极对分析物进行了高灵敏的电化学检测,该电极在反复用于实际尿样分析后也不会被污染。详见: Anal Chem, 2010, 82: 6895～6903。 4毛细管区带电泳表征接枝和非接枝乳清蛋白的氧化铁核/硅壳纳米粒子当今的生物医学分析检测中越来越多地引入纳米粒子。大家所关注的除量子点外,超顺磁性的氧化铁纳米粒子因在磁共振影像中作为造影剂,在热疗治疗、药物输送、肝细胞分离和纯化、荧光细胞标记以及脱氧核糖核酸(DNA)纯化中得到了广泛的应用。所有这些应用都需要对纳米粒子进行表面修饰。在前期的研究中,毛细管电泳方法主要用于表征生物大分子接枝的量子点纳米粒子。Varenne等报道了氨基酸/PEG双功能基团修饰的氧化铁核/硅壳的纳米粒子表面接枝α-乳清蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的毛细管电泳表征和分离方法。利用DDAB(didodecyldimethylammonium bromide)动态涂层或HPC(hydroxypropylcellulose)永久涂层修饰的毛细管,研究了使胶体溶液稳定并可与后续免疫分析兼容的优化分离条件,如温度、溶液pH、离子强度和电场强度等。纳米粒子的分散和聚集状态可由毛细管电泳轮廓图清晰表征;接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子在10 mmol/L 2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)/NaOH(pH 6.0)溶液中,在18～60 ℃范围内保持稳定,温度对二者的Zeta电位没有明显的影响;在不同pH(pH 4.5～8)缓冲液体系中,接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的迁移率差别不明显,仅当溶液的pH=4(小于乳清蛋白的pI)时,因接枝蛋白表面带正电荷,接枝蛋白纳米粒子的迁移率显著大于非接枝蛋白纳米粒子。考虑后续为适应抗原-抗体反应和接枝蛋白存储的稳定性,pH 6是最佳的选择;在电泳分析中,应用两种不同涂层的毛细管进行分离,电场强度对接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的影响有所不同:DDAB涂层的毛细管适合采用低电压分离,而HPC涂层的毛细管适合采用高电压分离。离子强度影响纳米粒子的稳定性和聚集状态,影响接枝蛋白和非接枝蛋白纳米粒子的聚集形成,并对两种粒子影响的阈值不同(接枝蛋白＞30 mmol/L,非接枝蛋白＞100 mmol/L)。该方法表明,毛细管电泳是表征纳米粒子功能化修饰过程随着时间、溶液条件等变化的简单有效的方法,在肉眼尚不能观察到其变化的时间(1～2 d)内,可以准确灵敏地检测其修饰和聚集状态,是纳米粒子常规表征方法的一种简便、快速和可行的替代方法。详见: Electrophoresis, 2010, 31: 2754～2761。