HCVNS4基因在大肠杆菌中表达及蛋白质提纯

应用PCR方法扩增出人丙型肝炎病毒全长NS4基因的DNA片段,克隆入表达载体pQE32并转化E.coliJM109.经IPTG诱导表达出42×l03蛋白.利用Ni-NTA-agarose纯化得到纯化产物,Western-blot鉴定该蛋白能够与抗NS4的单克隆抗体发生特异性反应.     

猪瘟病毒NS3蛋白的原核表达纯化和抗体制备

以猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA克隆pT7SM为模板,PCR扩增CSFV ns3基因N末端截短的cDNA片段.PCR产物经限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ双酶切消化后,克隆到经BamHⅠ和SalⅠ双酶切消化的pET-28a表达载体,构建重组质粒pET-ΔNS3,转化E.coli BL21-codonPlus (DE3),IPTG诱导重组蛋白表达.采用SDS-PAGE分离纯化非结构蛋白3(NS3)重组蛋白,免疫家兔,制备多克隆抗体.ELISA法及间接免疫荧光检测结果显示,该多克隆抗体效价在1×105以上,能分别与在大肠杆菌中表达的NS3重组蛋白或CSFV感染细胞中表达的NS3天然蛋白发生特异性结合反应.制备的NS3重组蛋白可用作建立NS3抗体ELISA检测方法的包被抗原 ;NS3抗体可用于检测CSFV病毒感染和NS3功能研究中的蛋白质鉴定.     

丙型肝炎病毒NS5B基因在昆虫细胞中的表达

将含有丙型肝炎病毒（HCV）NS5B基因的转移载体pBlueBac5B与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染Sf9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5B基因的重组病毒AcNS5B.提取重组病毒基因组DNA进行Southern分析,发现有一条1.8kb的DNA片段与标记的探针发生杂交.AcNS5B感染Sf9细胞后,在细胞中表达了分子量为66×103的蛋白,用Westernblot方法检查这种蛋白质,能与兔抗HCVNS5B抗血清发生特异的强烈反应.     

对虾肽Penaeidin-2在大肠杆菌中的融合表达及其抗细菌活性

采集南美白对虾血淋巴,从血细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增编码penaeidin-2成熟肽的开放阅读框cDNA序列,将其克隆至pGEM-T载体,进行序列测定,然后克隆至pET-32a(+)表达载体中,在E.coliOriga-mi B(DE3)pLysS中表达含6个His的重组对虾肽融合蛋白Pen-24,通过His Band resin Ni2+层析柱纯化获得Pen-24蛋白,采用纸片扩散法和液体生长抑制法检测该蛋白的抑菌活性.经SDS-PAGE分析,Pen-24蛋白的分子量为24.1×103.1μg对虾肽融合蛋白Pen-24与5 U的氨苄青霉素活性相当,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和抗氨苄青霉素大肠杆菌均具有抑菌活性.     

用宿主范围扩大的重组AcNPV在家蚕中表达TNF

用宿主范围扩大的核型多角体病毒双穿梭载体Bonpvid与重组转座质粒 pFast-TNF转座，使含有有TNF基因的表达盒插入Bonpvid的Tn7att的接受位点筛选阳性重组E.coli菌落，将提取的阳性重组子DNA分别转染家蚕BmN细胞和Sf-9细胞，获得了能表达TNF的重组病毒，SDS－PAGE和Western blot分析表明，TNF在上述两种细胞中得到表达，以家蚕作为生物反应器，将含有重组病毒的的细胞上清注射感染家蚕4龄幼虫，使TNF在蚕体表达，用BmN细胞中表达的TNF感梁肿瘤细胞，诱导细胞发生了凋亡。     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

设计和鉴定花生主要过敏原Ara h 2低致敏原衍生物

构建序列重新组合的Ara h 2表达载体,表达并纯化该蛋白,鉴定其低致敏原性。将Ara h 2基因进行合理的缺失和重排,并将重排后的基因T-Ara h 2克隆到原核表达载体pET-32a(+)上,然后转入Origami宿主表达菌中;再用IPTG诱导其表达;通过Ni2+亲和层析(FPLC)纯化目的蛋白;Western-blotti     

人γ干扰素/β肿瘤坏死因子融合蛋白His6融合表达及一步纯化

将人γ干扰素 /β肿瘤坏死因子融合蛋白 ( hγTNF-β)重组基因克隆于表达载体 p ET2 8,构建成T7lac启动子控制下的 His6融合表达质粒 ,转化溶源菌 E.coli BL 2 1 ( DE3 ) .经 IPTG( 1 m M)诱导表达 ,阳性菌在 SDS-PAGE泳图上出现一条粗表达带 ,其分子量 ( 3 2 k Da)与目的蛋白 His6-γ TNF-β)理论分子量相符 .薄层扫描与溶解性分析显示 ,表达产物占菌体总蛋白的 4 5%以上 ,主要为不溶性的包涵体( IBs) .离心分离 IBs产物 ,溶于 7M尿素中 ,然后通过 Ni柱进行亲和层析 ,即可获得一步纯化的表达产物(纯度为 96%、回收率为 91 % ) .纯化产物再经复性缓冲液稀释复性 ,其细胞毒比活性与抗病毒比活性分别达到 1 .2× 1 0 7～ 2 .0× 1 0 7u/m gp和 6.6× 1 0 5～ 7.2× 1 0 5u/mgp     

家蚕核多角体病毒双穿梭载体的构建及GFP和HBeAg融合蛋白的表达

用ＡｃＮＰＶ穿梭载体Ａｃ－Ｂａｃｍｉｄ与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,通过同源重组得到整合了ｌａｃＺ／Ｔｎ７ａｔ／ｍｉｎｉＦ表达盒的ＢｍＮＰＶＢａｃｍｉｄ,除能在大肠杆菌／ＢｍＮ细胞中穿梭复制外,还能感染ＢｍＮ－ＰＶ的非允许细胞Ｓｆ９,成功地构建了ＢｍＮＰＶ的双穿梭载体．经与重组转座质粒ｐＦＧＨｅ转座,获得了插入ｇｆｐ／ＨＢＶｅ融合基因的重组ｒＢｍ－Ｂａｃｍｉｄ（ｒＢｍＧＨｅ）,在家蚕细胞中表达了既能发射绿色荧光又具有ＨＢｅＡｇ抗原性的双功能融合蛋白．Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ为杆状病毒ＢａｃｔｏＢａｃ策略增添了一个新成员     

环加氧酶2基因的原核表达、抗体制备及其在肝癌中的表达

用PCR技术扩增环加氧酶2（COX-2）基因的C末端777bp的片段，插入到pET-28b（＋）中，构建原核表达载体．转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导产生包涵体形式his-COX-2融合蛋白．用镍离子螫合柱（Ni—NTA）纯化融合蛋白，获得纯度较高的原核表达蛋白．纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，用ELISA及Western blotting分别检测抗体．用此抗体Western blotting检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．ELISA及Western blotting结果显示免疫家兔所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价，并能够特异性的识别真核细胞中的环加氧酶2．用此抗体检测肝癌组织中的环加氧酶2的表达．证实肝癌组织中伴随有环加氧酶2的大量表达．同时所得的环加氧酶2抗体具有很高的效价和特异性，为进一步研究环加氧酶2的功能提供了条件。     

人t-PA P区在大肠杆菌中表达及其活性研究

用PCR方法获得编码人组织型纤溶酶原激活物（tissure-typeplasminogenactivator,t-PA）C端P区肽段的DNA,并经测序证实,长810bp,含有全部的t-PA的丝氨酸蛋白酶编码序列.将这段序列克隆到表达载体pQE30中转化大肠杆菌JM109菌株,经SDS-PAGE检测转化菌株中表达出分子量约29×103的蛋白,用纤维平板法测定激活纤溶活性,结果表明表达的t-PA蛋白C端P区具有很强的激活纤溶蛋白酶原的活性.证实t-PA蛋白C端P区的酶结构区的功能是独立的,其生物活性不受其它区域影响．     

重组pQE30 tPAr质粒在JM109菌株中的稳定性研究

将构建好的含有人变异tPA基因的重组pQE30 tPAr质粒的JM109菌株原始种子库菌种，在含Amp的平板培养基划线法连续传代至100代，其在固体培养基中生长速度、菌落形态和菌体形态、Amp抗性等方面与原始种子库无明显差异；每隔10代提取质粒DNA用HindⅢ和KpnⅠ限制性内切酶切割检查，酶切图谱没有改变；DNA测序未见tPAr基因变异．用原代和第100代培养诱导表达tPAr,表达水平和tPAr活性均无明显差异．菌体的SDS-pAGE图谱也完全相同．以上结果表明所建立的JM109tPAr工程菌株具有良好的遗传稳定性．     

兔防御素NP1在大肠杆菌中的表达

通过选用大肠杆菌偏好密码子对兔防御素基因进行改造，人工合成兔防御素基因并构建编码GST—NP1融合基因，从而在大肠杆菌中进行表达。研究表明：表达的蛋白质经过亲和层析洗脱纯化，SDS—PAGE电泳分析，在目的分子量处出现预期条带。灰度扫描分析表明，表达量最高可达细菌总蛋白的34．7％。经切割、复性后的防御素具有溶血活性。     

pEGFP-MEK1/Q56P重组质粒的构建及融合基因在293T细胞中的表达

构建第56位氨基酸发生突变的MEK1基因(MEK1／Q56P)与增强绿色荧光蛋白(EGFP)报道基因融合表达的真核重组质粒pEGFP-MEK1／Q56P，经限制性酶切及测序鉴定后，将其导入293T细胞中，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，同时进行Western blot检测。酶切鉴定及测序结果表明构建的pEGFP-MEK1／Q56P与预期结果一致，荧光观察及Western blot结果表明MEK1／Q56P和EGFP在293T细胞中能以融合蛋白的形式表达，且MEK1／Q56P能特异性活化ERK1／2，本研究成功构建了含有MEK1／Q56P的绿色荧光蛋白真核表达质粒，便于对Raf／MEK1／ERK1／2信号传导通路做进一步研究。     

寡聚脱氧核苷酸介导的体外多点定位突变——五点定位突变法改造枯草杆菌蛋白酶E基因

用５个化学合成的寡聚脱氧核苷酸片段作为诱变引物，对枯草杆菌蛋白酶Ｅ基因（ＡｐｒＥ）同时进行体外诱变．转化子经打点杂交及温度梯度洗膜法筛选出了若干在５个预定位点同时突变了的突变子，其突变效率达到５０％．同时还得到了１个四点突变的突变子．突变子经ＤＮＡ测序分析，充分肯定了突变的可靠性     

黄杆菌(Flavobacteriumsp.)ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌 ATCC2 75 5 1的 opd基因在大肠杆菌中的表达 ,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定 .通过 PCR扩增和 PCR产物直接克隆 ,将黄杆菌质粒上的一段长达 1137bp的 opd基因进行扩增及克隆 ,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体 p ET2 8b( )上 ,转化宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3) ,经 IPTG诱导 ,获得了较高量的基因表达产物 .该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内 ,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带 .工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。     

新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列,分别设计引物F₁、R₁和F₂、R₂,再以总DNA为模板,经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作,得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株,最终在4.0 mg·mL^-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达,每隔12 h取样并添加甲醇,96 h后离心收集发酵上清,经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带,大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达,先在37 ℃下培养90 min,再加入IPTG至1 mmol·L^-1后诱导7 h,离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后,进行SDS-PAGE蛋白电泳,同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量,其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL^-1,重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL^-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活,发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL^-1,经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL^-1。