马尾松毛虫CPV基因组第7片段的cDNA克隆及序列分析

利用琼脂糖凝胶电泳分离马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)基因组dsRNA,并回收纯化第7片段(S7).经逆转录和PCR扩增,获得2个亚克隆片段并测序.再根据已测序列设计引物,利用RNA连接酶介导的RACE法得到S7两端克隆并测序.通过拼接可得到DpCPVS7全序列.经过序列分析发现,S7全长1502bp,5′端具有CPV 1型末端保守序列AGTAA,3′端具有保守序列GTTAGCC.起始密码子ATG位于25～27残基,终止密码子TAG位于1373～1375残基,推测S7片段编码448个氨基酸多肽,分子量约为5.0×107.与舞毒蛾质型多角体病毒(LdCPV 1)和家蚕质型多角体病毒(BmCPV)第7片段相比较,核苷酸同源性分别为99%和86%.     

稀有(鱼句)鲫(Rare gudgeon)Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物,采用PCR技术在稀有(鱼句)鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增,发现3个大小分别为220、700和1 500 bp的片段,经过克隆和测序分析,从220 bp的片段中获得两个基因片段,证明为稀有(鱼句)鲫的Sox1和Sox21基因片段,无性别差异,其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1:80.4%和97%;Sox21:77.3%和91%,其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox1:96%和98%;Sox21:88%和100%,显示了其高度的保守性.此外,从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克隆的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据.通过对这些数据进行序列比对及聚类树的构建,分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式,对稀有(鱼句)鲫的性别决定进行了探讨,为Sox基因的进化研究提供分子基础.     

棉铃虫核型多角体病毒朝鲜分离株BamHI-Ⅰ片段的核苷酸序列分析

对在朝鲜首次分离得到的棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株(HaSNPV-KO)基因组BamHI-Ⅰ片段的全序列进行了测序与分析．该片段全长1．895kb．包括p26基因．p10基因及p74基因的3′末端序列．p26基因位于户10基因的上游．排列方向与p10基因相同，该基因的编码区大小为803bp，编码267个氨基酸，p10基因的编码区大小为261bp，编码87个氨基酸．p74基因的排列方向与p10和p26基因相反．棉铃虫核型多角体病毒朝鲜株与棉铃虫核型多角体病毒中国株(HaSNPV-g4株)的p26基因序列的同源性为99．8％，两个分离株的p10基因序列完全相同，而p74基因3′末端序列的结果有99．4％的同源性．朝鲜株与美洲株(HzSNPV)的p26和p10基因序列的同源性分别为98．8％，98．7％，而p74基因3′末端序列有97．9％的同源性．     

病毒颗粒的存在与其对水稻纹枯病菌的影响

存在有14.0 kb dsRNA的水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1 IA)Rs17菌株与存在有2.0 kb dsR-NA的Rs1M-3菌株经由菌丝融合试验结果发现,Rs1M-3菌株中2.0 kb dsRNA片段可经由菌丝融合而转移,融合试验中获得的6个融合成功的菌株与2个未融合成功的菌株在生长速度上并没有差异,但是6个带有2.0 kbdsRNA融合菌株在色素产生与菌核数目比未带有2.0 kb菌株少,初步认为2.0 kb dsRNA片段对色素产生、菌核数目多寡有影响.在Rs1M-3菌株中可以分离到球形、直径大小约20～25 nm的类似病毒颗粒(virus-like particle,VLP)其分子量大小约为60-70 kDa左右,此外经由Rs1M-3中类似病毒颗粒直接抽取病毒核酸进行电泳分析,发现其类似病毒颗粒的核酸为dsRNA,且两条分子量相近约2.0 kb dsRNA片段大小与直接由Rs1M-3菌丝中所抽取到的dsRNA是一致的.从本实验初步研究证实dsRNA可经由菌丝融合传播,2.0 kbdsRNA可能影响菌株菌核的形成且有病毒颗粒存在,对于dsRNA在水稻纹枯病菌上的作用与关系及其属于何属病毒有待未来更进一步的研究.     

稀有鮈鲫（Rare gudgeon）Sox基因的克隆及序列分析

根据人的SRY基因中HMG-box保守区设计引物，采用PCR技术在稀有鮈鲫雌雄个体基因组DNA中分别扩增，发现3个大小分别为220、700和1500bp的片段，经过克隆和测序分析，从220bp的片段中获得两个基因片段，证明为稀有鮈鲫的Sox1和Sox21基因片段，无性别差异，其DNA序列与人及斑马鱼相应Sox基因相似性分别为Sox1：80．4％和97％；Sox21：77．3％和9l％，其编码的氨基酸序列与人及斑马鱼相应SOX蛋白相似性分别为Sox：96％和98％；Sox21：88％和100％，显示了其高度的保守性．此外，从GenBank、MEBL和DDBJ数据库获得了92个已克降的物种SRY和Sox基因全长核苷酸编码序列及HMG保守区序列数据．通过对这些数据进行序列比对及策类树的构建，分析了Sox基因家族成员的分类及分子进化模式，对稀有鮈鲫的性别决定进行了探讨，为Sox基因的进化研究提供分子基础．     

黑胸大蠊浓核病毒基因组末端序列测定与分析

利用构建的黑胸大蠊浓核病毒(PfDNV)全基因组重组质粒(PfDNV-pUC119)以及一系列完整缺失克隆,通过全自动测序方法完成了PfDNV两末端各728 bp 和730 bp 核苷酸序列的测定. 通过计算机软件分析发现,PfDNV 末端201nt为倒置重复序列,其中最末端122nt为回文序列,能形成典型的发夹结构. 并与同科其它病毒末端序列进行了核苷酸序列同源性比较.     

草鱼出血病两种病原病毒的分离和致病性的研究

通过PEG和鱼精蛋白沉淀等方法,从草鱼(Ctenopharynogon idellus)出血病病鱼组织分离纯化出两种病毒.一种是直径70—80nm的病毒颗粒,六边形,有双层衣壳,无囊膜;另一种直径仅20—30nm的小病毒颗粒,也呈六边形.前者是呼肠孤病毒(Reovirus),以前已有报道;后者拟初步鉴别为小RNA病毒科(Picornaviridae)病毒.将两者分别感染1足龄健康草鱼,能复制出典型症状的草鱼出血病而致鱼死亡.呼肠孤病毒主要导致肠道出血的出血病,而小病毒颗粒导致肌肉出血为主的出血病.由此可以初步解释生产上出现两类出血病的原因.     

文山松毛虫质型多角体病毒(DpwCPV)多角体蛋白基因的cDNA克隆及序列分析

通过对文山松毛虫质型多角体病毒的增殖 ,纯化 ,获得一株单一类型的质型多角体病毒 提纯的病毒粒子经SDS 酚抽提 ,琼脂糖凝胶电泳分离基因组dsRNA ,低熔点琼脂糖电泳法回收纯化编码多角体蛋白的第十片段S10 S10经DMSO变性 ,逆转录合成cDNA第一条链 ,PCR扩增后 ,克隆在PMD18 T载体上 ,克隆片段全长 76 3bp 起始密码AUG位于第 3～ 5位碱基 ,终止密码UGA位于第 74 7～ 74 9位碱基 推测DpwCPV多角体蛋白基因编码一段由 2 4 9个氨基酸组成的多肽 ,分子质量为 2 84 39.4 4× 10 3 与舞毒蛾质型多角体病毒 (LdCPV)多角体蛋白基因比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 97% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 99% ;与家蚕质型多角体病毒(BmCPV)多角体蛋白基因相比较 ,两者核苷酸序列的同源性为 88% ,它们各自编码的多角体蛋白的氨基酸同源性为 97%     

草鱼出血病两种病原病毒的分离和致病性的研究

通过PEG和鱼精蛋白沉淀等方法，从草鱼(Ctenopharynogon idellus)出血病病鱼组织分离纯化出两种病毒一种是直径70-80nm的病毒颗粒，六边形，有双层衣壳，无囊膜，另一种直径仅20-30nm的小病毒颗粒，也呈六边形.前者是呼肠孤病毒(Reovirus)，以前已有报道，后者拟初步鉴别为小RNA病毒科(Picornaviridae)病毒.将两者分别感染1足龄健康草鱼，能复制出典型症状的草鱼出血病而致鱼死亡.呼肠孤病毒主要导致肠道出血的出血病，而小病毒颗粒导致肌肉出血为主的出血病.由此可以初步解释生产上出现两类出血病的原因.     

外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶基因cDNA

为真菌漆酶基因cDNA的克隆提供了一种简便快速的新方法．从含有内含子的灵芝漆酶基因出发，采用外显子拼接PCR方法，合成了灵芝漆酶的cDNA．设计了10对引物分别经PCR扩增该基因的10个外显子，引物设计使前一个外显子的下游引物与下一个外显子的上游引物都有一段同源匹配序列，然后通过两两片段混合作为模板PCR扩增得到两两拼接的外显子片段，再将得到的5个片段前两个混合，后3个混合分别作为模板扩增获得拼接好的外显子1～4大片段和外显子5～10大片段，最后将这两个大片段混合作为模板扩增得到拼接好的全长cDNA序列．与常规方法相比，该方法既避免了RNA的操作，又不用摸索酶表达的条件，可以和基因组步行技术结合快速获得真菌漆酶基因的cDNA．