绿色杜氏藻GGR基因生物信息学分析及表达研究

采用Illumina HiSeqTM 2000高通量测序方法获得绿色杜氏藻GGR基因(GenBank序号: KX100480) cDNA全长序列, 研究了甲基茉莉酸(MeJA)对绿色杜氏藻GGR基因表达的影响. 测序结果表明, 绿色杜氏藻GGR基因cDNA全长2356bp, 开放阅读框1539bp, 编码512个氨基酸, 分子量为52.2961kDa, 理论等电点为6.54. 序列分析结果表明, 该蛋白具有保守的ChlP结构域, 为可溶性蛋白, 具有跨膜区域, 无信号肽. TargetP 1.1 Server预测结果表明, 该蛋白可能定位于线粒体. 系统进化树结果表明, 绿色杜氏藻GGR蛋白较其他植物的GGR蛋白亲缘关系较 远. RT-PCR结果表明, 100?mol·L-1 MeJA可显著地提升绿色杜氏藻GGR基因的表达(P<0.01). 同时, 绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素含量达到最高, 说明GGR基因与绿色杜氏藻叶绿素和类胡萝卜素的合成存在一定关系     

盐胁迫下杜氏盐藻(Dunaliella salina)cDNA文库的构建与新表达序列标签(EST)的获取、分析

在成功养殖杜氏盐藻(Dunaliella salina)的基础上,采用Takara cDNA文库构建试剂盒,构建盐胁迫下(1.5 mol/L NaCl)杜氏盐藻的cDNA文库.经鉴定,原始文库的滴度达1.2×106 cfu/mL,重组率高达95%,且多数插入片段均在500 bp以上.对表达序列标签(expressed sequence tag,EST)分析发现,杜氏盐藻基因组中包含大量未鉴定的新基因.随机挑取60个单克隆进行序列测定,将所测序列经Blast比对等生物信息学方法分析后,发现其中三分之一,即20个未见报道的代表新基因的表达序列标签,值得进一步发掘.这些新表达序列标签(基因)的发现,为进一步筛选和克隆杜氏盐藻耐盐性基因提供了筛选平台.     

半滑舌鳎两种Aquaporinl同源基因的克隆与表达分析

克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AQP1o和AQP1基因的全长cDNA序列,并对其序列和表达模式进行了分析.结果表明,AQP1o cDNA全长为993 bp,包括120 bp的5'非翻译区,789 bp的开放阅读框,84bp的3'非翻译区,编码262个氨基酸的蛋白质,分子质量为28.3×103.AQP1的cDNA全长为1 335 bp,包括63bp的5'非翻译区,786 bp的开发阅读框,486 bp的3'非翻译区,编码261个氨基酸的蛋白质,分子质量为27.4×103.聚类分析表明半滑舌鳎AQP1o蛋白与金头鲷和塞内加尔鳎等海洋鱼类在卵巢中特异表达的AQP1o聚为一类,而AQP1与非卵巢特异表达的AQP1聚为一类,表明该两类基因为不同类型的AQP1同源基因.RT-PCR分析表明两个基因具有不同的表达模式,AQP1o主要在卵巢中表达,提示其在卵巢中具有特定的生理功能、而AQP1则在雌雄鱼的多种组织中表达.     

北美海蓬子胆碱单加氧酶基因CMO的克隆及表达研究

胆碱单加氧酶(CMO)是合成植物小分子非毒性有机渗透调节物质甜菜碱过程中重要的限速酶.文中采用RACE技术以北美海蓬子为实验材料克隆CMO基因的全长c DNA序列(Genbank登录号:KM884944),并做相关的生物信息学分析.研究结果表明,该基因c DNA全长1 834 bp,其中开放阅读框(ORF)有1 317 bp,编码439个氨基酸,预测其蛋白分子量为49.537 k Da,理论等电点(p I)为6.15;序列分析显示北美海蓬子CMO蛋白中含有2个重要的保守域和功能域,不存在跨膜区域;除了与蒺藜苜蓿及水稻的同源性分别为46%和49%外,与其他植物CMO蛋白序列相似性均达到55%以上;系统进化树分析显示,它与欧洲海蓬子的亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,随着Na Cl浓度的升高,北美海蓬子CMO基因的表达量增加,说明该基因可通过盐胁迫诱导表达.     

北美海蓬子甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆及表达载体构建

以北美海蓬子种子为材料, 采用RACE技术获得北美海蓬子BADH基因的cDNA全长序列. 结果表明: BADH基因cDNA全长为1836bp, 其中开放阅读框(ORF)为1503bp, 编码500个氨基酸, 预测蛋白的分子量为54.5kDa, 理论等电点为5.31. 推测出BADH氨基酸中含有甜菜碱醛脱氢酶家族高度保守的十肽序列(VTLELGGKSP)及与酶功能相关的半胱氨酸残基(Cys). 序列比对和系统进化树显示, 北美海蓬子与盐节木和盐穗木的亲缘关系最近, 同源性达94%. 并构建了植物表达载体pCAMBIA3301-BADH, 将其成功导入到农杆菌EHA105中, 为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

不同起始密度对等鞭金藻和三角褐指藻种间生长的影响

通过共培养方法,研究了不同起始密度对等鞭金藻和三角褐指藻种间生长作用的影响．结果显示：不同起始密度对等鞭金藻和三角褐指藻种间生长竞争具有明显的影响．3种不同的接种比例下,三角褐指藻在与等鞭金藻的竞争中始终占优势,而且随着接种密度的增加,三角褐指藻在种间生长竞争中的优势更加明显．在接种比例为I：Q=4：1时,等鞭金藻对三角褐指藻的生长也会产生一定的抑制作用．     

褶纹冠蚌热休克蛋白HSP7O基因的克隆及表达研究

运用兼并引物结合RT-PCR方法从褶纹冠蚌(Cristaria plicata)血细胞中克隆出热休克蛋白70(HSP70)的cDNA序列.用半定量PCR方法研究了HSP70 mRNA在褶纹冠蚌不同组织的表达情况.结果表明:HSP70cDNA全长为2664 bp,5’非编码区364个核苷酸,3’非编码区383个核苷酸,开放阅读框为1917 bp,编码638个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白理论等电点为5.61,分子量为70.3 kD.HSP70基因不含内含子.氨基酸序列分析发现,推导的氨基酸序列含有HSP70家族的3个标签序列(I10 DLGTTYS17,V198 FDLGGGTFDVSIL211和V336VLVGGSTRIPKV QK350).氨基酸序列同源性比较显示HSP70与紫贻贝(Mytihcs galloprovincialis)和美洲牡蛎(Crassostrea virginica)氨基酸序列同源性分别为79.47％和77％.半定量PCR分析显示在正常褶纹冠蚌血液、外套膜、鳃、闭壳肌和肝胰腺5种组织中均能检测到HSP70的基因表达.经过热休克或病原菌刺激后,蚌各组织中HSP70 mRNA的表达显著增加,其中热休克处理后,蚌的鳃和血液中HSP70 mRNA表达量增加最为显著;而嗜水气单胞菌刺激后蚌的肌肉和鳃组织中HSP70 mRNA表达量增加最明显.     

半滑舌鳎DMRT 1基因的克隆与表达分析

利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的DMRT 1基因;并用RT-PCR技术检测了该基因在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼的不同组织的表达情况.结果表明,该基因cDNA序列全长1 232 bp(GenBank登录号为EU007655),包括774 bp开放阅读框,131 bp5′非翻译区以及含poly(A)信号的329 bp的3′非翻译区,编码258个氨基酸.氨基酸序列同源性分析表明,半滑舌鳎DMRT1氨基酸序列与牙银汉鱼、黑鲷、青鳉、河豚和斑马鱼DMRT1氨基酸序列的同源性分别达到了63%、59%、54%、53%和52%;与光滑爪蟾、小鼠和人类的同源性较低分别为38%、42%和41%.RT-PCR分析表明,DMRT 1基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5、13、18、22和35 d的仔鱼均有表达,在孵化后22 d表达量最高.在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达,其他组织均无表达,表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成.     

翘嘴鳜铜锌超氧化物歧化酶基因的分子克隆与原核表达

运用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)铜锌超氧化物歧化酶(命名为ScCu/Zn-SOD)基因,该基因的cDNA序列全长为804bp,开放阅读框为465bp,编码154个氨基酸。氨基酸序列中含2个Cu/Zn-SOD标签序列、7个铜锌金属结合位点、2个半胱氨酸位点和1个N-糖基化位点;其与胞内Cu/Zn-SOD(icCu/Zn-SOD)和胞外Cu/Zn-SOD(ecCu/Zn-SOD)氨基酸序列的同源性分别为60.13%~92.21%和33.77%~42.21%。在系统进化树中,ScCu/Zn-SOD与其它物种的icCu/Zn-SOD聚成一支。ScCu/Zn-SOD的蛋白晶体结构主要由2个α螺旋和8个β折叠组成,呈β折叠构象,通过结合1个Cu2+和1个Zn2+构成其酶活性中心。ScCu/Zn-SOD的mRNA在翘嘴鳜肌肉、鳃、肝脏和肾脏等组织中均有表达,且鳃中的相对表达量最高。将该基因编码蛋白序列与pET-30a表达载体重组,热激转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,SDS-PAGE检测发现诱导后菌液的超声上清中有可溶性重组蛋白表达。     

凡纳滨对虾亲环素A基因的克隆及表达分析

通过电子克隆所得基因序列设计引物,采用RT-PCR方法首次克隆得到长度为885 bp的凡纳滨对虾亲环素A（Cyclophilins A）CYPA基因cDNA序列,其开放阅读框为35~529 bp,可编码164个氨基酸.推算其分子量约为17.6×103,理论等电点为8.55.与其他物种的CYPA基因比对发现,该基因的氨基酸序列具有较高的保守性.基于氨基酸序列的聚类分析表明,凡纳滨对虾与斑节对虾的亲缘关系最近.荧光定量PCR的结果显示该基因在组织中广谱表达,在抗病组中,胃中的表达量最高,心脏中的表达量最低,差异约为2倍.而在感病组中,该基因在心脏中的表达量最高,肌肉中的表达量最低.利用ProtFun在线预测蛋白质的功能分类,表明CYPA基因可能是一免疫应答抑制因子,参与凡纳滨对虾免疫防御反应.     

水稻高温、干旱响应基因OsHdr5的克隆与表达谱分析

低温、高温、干旱等非生物逆境通常会严重影响到水稻的生长及产量.为深入了解水稻逆境反应的分子机理和挖掘耐逆相关基因,本文采用Affymetrix水稻表达芯片对水稻多逆境下的全基因组表达谱进行分析,并筛选出众多表达特异基因.OsHdr5是其中一个在多个生长发育时期与组织器官中受高温、干旱诱导均显著上调的基因,用实时定量PCR方法(real-time PCR)对其表达水平进一步分析,两组结果基本吻合.用PCR方法扩增获得长为743bp的全长基因序列,其ORF区编码167个氨基酸残基,组成的肽链含有磷酸化激酶位点,形成的二级结构包含一个由6个α螺旋和2个β折叠组成的跨膜结构域,进一步分析推测其可能是叶绿体膜上与细胞跨膜信号传递相关的功能蛋白.     

黄杆菌(Flavobacteriumsp.)ATCC27551 opd基因在E.coli中的克隆及表达

研究了黄杆菌 ATCC2 75 5 1的 opd基因在大肠杆菌中的表达 ,并对于表达产物进行了胞内定位和酶活测定 .通过 PCR扩增和 PCR产物直接克隆 ,将黄杆菌质粒上的一段长达 1137bp的 opd基因进行扩增及克隆 ,然后按正确的读码框亚克隆于表达载体 p ET2 8b( )上 ,转化宿主菌 E.coli BL 2 1(DE3) ,经 IPTG诱导 ,获得了较高量的基因表达产物 .该表达产物以包涵体的形式存在于细胞内 ,通过分离包涵体可以得到电泳较纯的条带 .工程菌的细胞活性达到原始菌株黄杆菌的水平     

坛紫菜hsp70基因克隆与表达

HSP70家族是一类最保守和最重要的热应激蛋白家族,在藻类中编码HSP70家族的基因也是普遍存在的,从原始单细胞藻到多细胞的大型藻,hsp70基因在藻类适应环境的过程中起了重要的作用.为了进一步探讨hsp70基因的生物学作用及其在系统进化中的保守性,研究采用简并PCR,扩增获得了坛紫菜(Porphyra haitanensis)hsp70基因片段,随后利用基因组步移获取了坛紫菜hsp70基因全序列.该基因全长2449个碱基,其中1866bp为编码区域,共编码621个氨基酸,与同属紫菜(P.purpurea)hsp70的氨基酸一致性达90%以上.利用Real-time PCR技术研究热激及恢复过程中坛紫菜hsp70的表达情况,结果表明:坛紫菜hsp70对热激应答极为迅速,35℃热激15 min,hsp70 mRNA的表达就提升了15倍;在恢复培养3 h后坛紫菜hsp70的表达进入第二个高峰,表达量提升了48倍,且在随后的过程中始终高于对照值.在整个热激处理中,坛紫菜HSP70蛋白除了作为胁迫的应激蛋白外,始终作为重要因素参与了防御与损伤修复的过程.     

ltB-ureB融合基因原核表达系统的构建及其产物免疫性和佐剂活性的鉴定

构建ltB-ureB融合基因原核表达系统并对其表达产物的免疫性和佐剂活性进行鉴定.采用PCR和T-A克隆法从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)临床菌株Y06和大肠杆菌44851株DNA中获得了ureB和ltB全长基因扩增片段及其克隆,并构建了ltB-ureB融合基因及其原核表达系统pET32a-ltB-ureB-E.coli BL21DE3.在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导表达,并用Hp全菌抗体的Western blot、ELISA以及GM1ELISA分别证实了目的重组蛋白(rLTB-UreB)的免疫性和佐剂活性.与报道的相关序列比较,所克隆的ureB和ltB核苷酸序列同源性分别为96.88%～97.82%和99.12%～99.71%,氨基酸序列同源性为99.65%～99.82%和97.58%～99.19%.0.1～1.0 mmol/L的IPTG均能有效地诱导目的重组蛋白rLTB-UreB的表达,该蛋白主要以包涵体形式存在,其产量约为细菌总蛋白的35%.Western blot结果证实rLTB-UreB不仅能与商品化的Hp全菌抗体结合,免疫家兔后也能产生特异性抗体,表明rLTB-UreB有良好的免疫反应性及抗原性.GM1-ELISA结果显示rLTB-UreB能与牛GM1结合,表明rLTB-UreB有佐剂活性.以兔抗rLTB-UreB为一抗,发现所检测的109株Hp临床分离菌株均表达UreB;以rLTB-UreB为包被抗原,发现所检测的125例Hp感染者血清中均存在UreB抗体;表明UreB广泛存在于不同的Hp菌株中,并有很强的抗原性,也提示rLTB-UreB确有自然表达UreB的抗原特异性.本文成功地构建了LTB-UreB融合基因原核高效表达系统,所表达的LTB-UreB融合蛋白有良好的免疫性和佐剂活性,为Hp基因工程疫苗的产业化奠定了坚实的基础.     

Quox-1基因同源序列在豚鼠精子形成中的表达

以地高辛标记的 Ｑｕｏｘ１ 基因ｃ Ｄ Ｎ Ａ 的ｃ３ 片段为探针,与豚鼠基因组 Ｄ Ｎ Ａ 作 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交,结果表明,在豚鼠基因组中存在 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列以抗 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白的特异性抗体对成年豚鼠睾丸、附睾和幼年豚鼠睾丸的组织切片进行免疫组织化学分析,发现在豚鼠精子发生中精子细胞分化为精子阶段有类 Ｑ Ｕ Ｏ Ｘ１ 蛋白表达,提示 Ｑｕｏｘ１ 基因同源序列可能对豚鼠精子发生中的精子形成过程有调控作用     

突变型绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞和幼虫中的表达

用细菌—杆状病毒穿梭系统（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）将一套含有绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐＳ６５Ｔ）和完整多角体蛋白基因的表达盒转座到ＡｃＮＰＶ－Ｂａｃｍｉｄ的Ｔｎ７转座接受位点,从而构建出一种带有ｇｆｐ基因和完整多角体基因的重组杆状病毒,用这一重组病毒感染细胞能稳定地形成多角体,并在紫外光照射下产生强烈的绿色荧光,以重组病毒感染粉纹夜蛾（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）幼虫后,在阳光下即可看到发射绿色荧光的幼虫,在手提式长波紫外光照射下绿色荧光更为强烈,带绿色荧光的幼虫在昆虫生态学和杆状病毒流行病学等研究领域有广泛的用途     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.