浙江沿海大弹涂鱼、弹涂鱼的线粒体COI基因序列差异及其系统发育

为探讨浙江沿海大弹涂鱼和弹涂鱼线粒体细胞色素氧化酶I号(COI)基因序列差异及其系统发育, 对两者进行了COI扩增、测序和分析. 结果显示: 扩增得到大弹涂鱼、弹涂鱼COI基因序列长度分别为1554bp和1556bp; 大弹涂鱼和弹涂鱼COI基因序列中, 所占比例(分别为55.8%和56.0%)均高于 所占比例(分别为44.2%和44.0%); 大弹涂鱼和弹涂鱼的种内平均遗传距离分别为0.002和0.003, 两者的种间遗传距离为0.183. 构建的系统发育树显示, 大弹涂鱼与红狼牙虾虎鱼、孔虾虎鱼、犬齿背眼虾虎鱼聚为一簇(大弹涂鱼COI序列与三者的同源性分别为91.0%、92.0%和88.0%), 弹涂鱼与青弹涂鱼聚为一簇(两者COI序列同源性为99.0%)后与大弹涂鱼所在的簇相聚. 研究结果可为探讨大弹涂鱼、弹涂鱼的系统发育及建立基于COI序列的弹涂鱼类鉴定方法提供参考资料.     

菊花EST-SSR标记的开发与应用

从NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库下载7 259条菊花相关表达序列标签(EST)序列,经去除冗余序列拼接后得到3 784条Uni-ESTs,总长度为2 088.6kb.用MISA软件查找其简单重复序列(SSR)位点,共获得407个SSR位点,分布于355条EST上,出现的频率为10.76%.在搜索到的EST-SSR中,三核苷酸重复类型占主导地位,所占比例为47.42%.共观察到76种重复基元,出现最多的重复基元是A/T和ACC/GGT,其次为ATC/ATG,AAC/GTT,AC/GT,AAT/ATT.根据搜索结果随机设计了24对菊花EST-SSR引物,对14个菊花品种进行PCR扩增,发现有12对引物有较清晰且稳定的扩增产物(其中10对引物的产物存在多态性),共检出37个位点(其中多态性位点32个),平均每对引物可扩增出3.2条多态性片段.遗传相似性分析显示,14个品种的遗传相似系数在0.61～0.84之间,平均相似系数为0.67.     

泥蚶线粒体COI和16S rRNA基因片段序列研究

采用PCR技术扩增了泥蚶线粒体DNA的COI和16S rRNA基因片段,PCR产物经T载体连接后进行克隆、测序,用MEGA version 3.0软件计算这2个基因片段序列碱基组成.结果显示：COI和16S rRNA基因删除引物序列后分别得到660bp和548bp的核苷酸序列,T,C,A和G碱基含量分别为40.4%,14.7%,20.6%,24.3%和23.2%,25.9%,30.3%,20.6%.COI和16S rRNA基因片段对泥蚶不同地理种群的遗传分化的研究具有一定的应用价值.     

5种体色瓯江彩鲤线粒体COⅡ基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var．color）线粒体DNA的COⅡ基因,测定该基因片段序列．分析了瓯江彩鲤“全红”、“粉玉”、“粉花”、“麻花”和“大花”共20只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态性．结果表明,“大花”和“全红”遗传多样性最为丰富,“粉花”的遗传多样性相对贫乏．在长度为604bp的基因片段中,共检测到9个多态性核苷酸位点（占1．49%）,20只个体具有4种基因型,5种体色各自的平均核苷酸位点差异分别为0．38％、0．2％、0、0．13％和0．47％．UPGMA分子系统聚类树显示,“粉花”、“麻花”和“粉玉”的遗传关系接近;“全红”相对独立成一支,与其他4种体色瓯江彩鲤的遗传关系较远．COⅡ基因可以作为区分三分支群体的遗传标记．     

5种体色瓯江彩鲤线粒体COII基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var．color）线粒体DNA的COⅡ基因,测定该基因片段序列．分析了瓯江彩鲤“全红”、“粉玉”、“粉花”、“麻花”和“大花”共20只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态性．结果表明,“大花”和“全红”遗传多样性最为丰富,“粉花”的遗传多样性相对贫乏．在长度为604bp的基因片段中,共检测到9个多态性核苷酸位点（占1．49%）,20只个体具有4种基因型,5种体色各自的平均核苷酸位点差异分别为0．38％、0．2％、0、0．13％和0．47％．UPGMA分子系统聚类树显示,“粉花”、“麻花”和“粉玉”的遗传关系接近;“全红”相对独立成一支,与其他4种体色瓯江彩鲤的遗传关系较远．COⅡ基因可以作为区分三分支群体的遗传标记．     

卡罗藻有毒株与无毒株对菲律宾蛤仔的生长、存活及生理生化的影响

剧毒卡罗藻对双壳类生理生化过程的影响尚待研究解明. 本文以菲律宾蛤仔为对象, 比较研究了细胞大小形态一致的剧毒卡罗藻和无毒周氏卡罗藻对菲律宾蛤仔的生长、存活、摄食生理以及糖原含量的影响. 结果显示, 2种卡罗藻喂养下, 菲律宾蛤仔稚贝均有生长, 但有毒组的生长指标和存活率均显著低于无毒组. 其滤水率和摄食率与藻密度呈近似幂函数相关, 15×10⁵ cells·L^-1为拐点藻密度; 小于或等于此藻密度时, 2组的摄食率和滤水率随密度增加而增加, 且无显著差异; 大于此密度时, 有毒藻组滤水率和摄食率均显著低于无毒藻组. 成贝较稚贝能耐受更高有毒藻密度. 摄食2种卡罗藻后, 菲律宾蛤仔各组织均快速累积糖原, 外套膜糖原含量最高, 变化最为显著. 但糖原累积量与藻密度有关, 低藻密度组中, 有毒藻组的糖原含量显著低于无毒藻组. 研究结果表明, 剧毒卡罗藻可以通过降低贝类摄食能力、干扰生化代谢等非急性致死过程来影响贝类的生长及存活.     

10种杓兰属植物rDNA ITS序列的克隆与分析

以10种杓兰属植物为材料,利用PCR技术从叶片DNA克隆ITS序列.测序结果表明,10种杓兰属植物ITS的长度为522-572 bp,变异位点194个,其中信息位点99个,单核苷酸变异位点95个;5.8S序列的长度均为170 bp,但变异位点十分丰富,其中信息位点30个,单核苷酸变异位点20个,利用这些位点可将10种杓兰属植物完全分开.系统发育分析结果表明,所研究的植物可分为三组,绿花杓兰、西藏杓兰、黄花杓兰和紫点杓兰聚为一组,高山杓兰、大花杓兰、褐花杓兰和杓兰聚为一组,斑叶杓兰和离萼杓兰聚为一组.序列已上传至NCBI,登陆号为JN018070-JN018079.本研究克隆和分析了10种杓兰属植物的ITS序列,为遗传多样性和系统发育研究奠定了基础.     

瓯江流域唇NFDA1和花NFDA1线粒体COⅡ基因部分序列分析

采用PCR技术获得了唇NFDA1(Hemibarbus labeo)和花NFDA1(H. maculatus)线粒体DNA细胞色素氧化酶(COⅡ)基因部分序列,将所得的COⅡ基因序列与4种取自GenBank的NFDA1属鱼类同一基因序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、种群遗传结构和分子系统发生研究中的应用价值.测序结果表明,在实际分析的600 bp序列中,序列A T含量(56.9%～57.8%)高于G C含量,物种间共有变异位点116个,其中简约信息位点46个;唇NFDA1和花NFDA12个地理种群间变异位点均为11个,唇NFDA1种群间碱基替换均为转换,花NFDA1的转换/颠换为8/3.以COⅡ基因片段序列为标记,用似刺鳊鮈(Paracanthobrama guichenoti Bleeker)作外群,构建了NFDA1属鱼类的系统发生树,其拓扑结构显示2个地理种群浙江花NFDA1单倍体Ⅰ(H1)与江苏花NFDA1首先聚为一支,然后与浙江花NFDA1单倍体Ⅱ(H2)形成一个单系群.韩国唇NFDA1和日本NFDA1为姐妹群,然后与中国花NFDA1(浙江和江苏)相聚为一支.长吻NFDA1和朝鲜NFDA1单独聚为一支,表明2者的亲缘关系较近.结果同时表明,韩国唇NFDA1与江苏花NFDA1、日本NFDA1和浙江花NFDA1(H1)的遗传距离均为0.008 4,结合形态特征鉴定,推测韩国唇NFDA1和日本NFDA1是中国花NFDA1(浙江和江苏)的同物异名.     

鄱阳湖流域华溪蟹属DNA条形码

探讨DNA条形码分子标记作为华溪蟹属(Sinopotamon)淡水蟹类辅助分类工具的可行性。选取分布于鄱阳湖流域的6种华溪蟹属淡水蟹类78个样本,采用线粒体COI和16SrRNA基因片段以及ITS2核基因片段,作为分子标记,结合GenBank数据库中同属序列片段,经DNA提取、引物筛选、PCR扩增、产物纯化测序及测序数据处理和分析,在计算得到的遗传距离和所构建系统发生树进行华溪蟹DNA条形码标准基因的选择。在本实验涉及的淡水蟹类个体及类群的识别上,16SrRNA和ITS2基因片段不适宜作为DNA条形码标准基因,而COI基因片段结合GenBank部分华溪蟹属序列数据分析,可区分本次研究所涉及的75%的物种。以线粒体COI基因片段为DNA条形码标准序列,可作为华溪蟹属淡水蟹类物种鉴定的辅助分类工具。     

寒兰转录组SSR信息分析及其分子标记开发

寒兰(Cymbidium kanran)是中国传统名花,其观赏与经济价值极高。简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),又名微卫星标记,有多态性高,非共显性等优势。基于转录组数据对SSR标记的开发具有经济效能高等优点,通过高通量测序平台对寒兰EST-SSR标记进行开发,了解其在转录组序列中的分布类型及特性,为寒兰的SSR多样性的分析及遗传图谱构建奠定基础。通过MISA程序筛选寒兰转录组测序得到的68699条unigene(序列总长60.06 Mb),并分析了其SSR位点分布情况,获得了9837个SSR位点,在总unigene的比例为14.32%,平均每6.25kb出现1个SSR。SSR位点中二核苷酸重复频率达到最高,占55.22%,其中AG/CT高达38.83%;接下来为三、单核苷酸重复,频率依次为25.37%和14.49%。利用Primer3共设计出6017对SSR引物。随机选取141对引物进行PCR扩增,有79对引物扩增得到的条带清晰可重复,15对在15个不同地区寒兰中表现出多态性。结果表明,本研究中设计的SSR引物在寒兰遗传多样性分析中具有较高的适用性,可用于寒兰的遗传研究。     

5种蚌螨ITS2基因片段序列及其系统发育分析

对5种蚌螨ITS2基因片段进行了序列测定,经比对后发现序列长度为258 bp(含gap);其中保守位点186个,可变位点57个,总变异率达到22.1%,种间变异率在7.4%~14.9%之间;转换位点11个,颠换位点18个,转换颠换比值为0.61。A,G,C,T4种碱基的平均含量分别为29.5%、17.2%、18.1%、35.2%,平均     

利用PCR-RFLP技术分析拟穴青蟹抗菌肽基因SCY2的SNP位点

本研究根据公布的锯缘青蟹SCY2基因序列设计引物SCY2-RFLPs和SCY2-RFLPa,利用PCR-RFLP技术分析了5个地理群体（宁德、汕头、万宁、东方、三亚）共计148个拟穴青蟹SCY2基因的多态性.结果表明,所扩增的SCY2基因片段含有2个StuⅠ内切酶识别位点,位于第一外显子的位点没有多态性,位于第一内含子的位点存在多态性.在148个个体中共检测到AA和AB两种基因型,等位基因B的出现频率非常低,只在三亚群体的1个个体中检测到,而在其他4个群体中均未检测到,其等位基因频率为0.003 4.序列分析结果表明,扩增片段长度为1 016 bp,包含部分5′非翻译区（282 bp）、第一外显子（131 bp）和部分第一内含子（603 bp）.AA基因型表现为3条带（从大到小依次为509,356,151 bp）,AB基因型表现为4条带（从大到小依次为660,509,356,151bp）.B等位基因是由于867 bp处发生了C→G的单碱基突变导致StuⅠ内切酶失去了1个识别位点而形成的.     

水蕨的生境及其遗传多样性分析

对分布在中国的24个现存水蕨种群和历史记载曾经分布但现已绝迹的22个水蕨种群原产地进行了广泛调查，发现绝迹种群所在地的原生境已遭到严重破坏，其水体pH值和电导率的平均值都高于现存种群所在地（P〈0．05）．结果表明水蕨的濒危与水生生境破坏和丧失密切相关．用inter-简单重复序列（ISSR）标记分析了13个水蕨种群遗传多样性．总的多态位点百分率（PPB）为65．19％．分子变异分析（AMOVA）表明种群间的遗传变异为33．91％．结果显示水蕨在物种水平具有一个中间水平的遗传多样性和种群间低的遗传变异．孢子扩散引起的高的基因流可能是导致水蕨种群间低的遗传变异的主要原因．     

伪狂犬病毒糖蛋白H基因片段的克隆、序列测定和分析

对伪狂犬病毒湖北地方株(PRVHB株)糖蛋白H基因片段进行了扩增、克隆、序列测定和分析,比较了该序列与PRVKa株及NIA-3株三者之间的同源性.结果显示,克隆片段长1396bp,G+c含量75.6%,包括糖蛋白H(gH)N端283个氨基酸编码区及上游调控序列和胸苷激酶(TK)C端136个氨基酸编码区.gH基因ORF上游调控区存在有TATA框和CAT框的真核启动子特征结构.PRVHB株gH基因片段序列与PRVKa株和N1A-3株相应序列的核苷酸同源性相同,为99.6%.推导的gH多肽N端第1～30位氨基酸组成的肽段富含疏水性氨基酸,具有真核信号肽的序列特征.     

濒危植物长叶榧群体不同年龄级遗传多样性的RAPD和ISSR分析

按胸径将浙江省桐庐县白云源森林公园长叶榧群体划分为成体、小树、幼苗3个年龄级,利用RAPD和ISSR分子标记对不同年龄级的遗传多样性及遗传分化进行分析.12个RAPD引物和12个ISSR引物分别扩增出199和180个条带,总多态位点百分率分别为44.72%和56.11%.RAPD和ISSR分析均显示3个年龄级的多态位点百分率、Shannon信息指数、Nei指数以成体最高,小树次之,幼苗最低,表明长叶榧群体遗传变异呈衰退趋势.分子方差分析(AMOVA)表明长叶榧群体不同年龄级内、年龄级间均存在遗传变异,但遗传变异主要存在于年龄级内.RAPD和ISSR分析显示,长叶榧群体不同年龄级间的遗传分化系数(Gst)分别为0.2869、0.3077,基因流(Nm)分别为1.2412、1.1231.长叶榧群体不同年龄级间的遗传相似度以幼苗与小树最高,遗传距离以幼苗与小树间最小.在长叶榧群体不同年龄级中,ISSR能检测到比RAPD更多的遗传变异,经Mantel检验,两种分子标记的分析结果相关性极显著.     

浙江天台山不同海拔高度七子花种群遗传多样性及其与环境因子的相关性分析

采用RAPD技术对浙江天台山3个海拔高度的七子花(Hepatacodium miconioides)天然种群的遗传多样性、遗传分化以及与环境因子的相关性进行了研究.12种随机引物在60株个体中共检测到122个可重复的位点.3个种群多态位点百分率为18.85%～23.77%,平均为21.86%,表明各种群的遗传多样性水平比较低.3个种群Shannon和Nei指数平均为0.132 9、0.092 5,其值较低.虽然3个种群所分布的地理范围小,但种群间存在明显的遗传分化,Shannon指数所显示的总遗传多样性中,种群内占33.58%,种群间占66.42%.Nei指数显示的种群间遗传分化系数为0.654 6.种群间的基因流很小,仅为0.265 6.3个七子花种群间的遗传相似度平均为0.712 6,遗传距离平均为0.341 2.海拔990 m种群与海拔780 m种群的遗传相似度较高,海拔500 m种群与其它两种群的相似度较低.七子花种群内的遗传多样性与土壤总氮呈极显著的正相关.     

基于 ITS 序列探讨睡莲属植物的系统发育

对睡莲属Nymphaea L．11个种和外类群中国莲Nelumbo nucifera Gaertn．nrDNA的ITS区(包括ITS-1，5．8SrDNA和ITS-2)进行了序列测定．睡莲属植物的ITS序列总长度为678～711bp，ITS-1和ITS-2序列长度范围为246～275bp和266～275bp．当空位(gap)作缺失处理时，睡莲属植物ITS区全序列排序后的长度为735位点，其中有265个(101个位点在ITS-1区，164个位点在ITS-2区)为系统发育的信息位点．以Nelumbo nucifera Gaertn．为外类群，利用PAUP4．0b4a软件。采用最大简约法分析获得了2个最简约树，其步长为658，一致性指数(CI)和维持性指数(RI)值分别为0．8450和0．8555．利用2个最简约树获取严格一致树，结果表明：热带睡莲植物和耐寒睡莲植物分别聚成一支构成姊妹群，这与基于起源和对生态条件的不同要求、或根据心皮的排列方式而对睡莲属植物进行的传统分类一致．在热带睡莲植物内形成两个亚支，其内部支持率均为100％；耐寒睡莲植物内也形成了两个亚支，内部支持率分别为98％和85％．     

新城疫病毒HB 92株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)无毒耐热株(HB92株)M基因，将其克隆于pGEM-T载体，并进行了序列测定和分析．结果显示，测定的M基因长1223个核苷酸。包含一个1095个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸．与已报道的10株NDVM基因比较，核苷酸同源性为88．4％～95．8％，氨基酸同源性为89．8％～95．3％。HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高(达95．8％)．NDVM蛋白分子中有9对碱性氨基酸。在多肽的第117～120位有一个含4个氨基酸CKKS的特征性结构．这些结果为揭示NDV HB92株的分子生物学背景，了解NDV的分子进化和遗传变异机理，进而开发利用HB92株奠定了基础，也为将NDV另列为副粘病毒亚科的一个新属提供了理论支持．