| 热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用 |
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| 引用本文： | 朱术会,邹秉杰,武海萍,马寅姣,陈颖,周国华.热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用[J].分析化学,2010,38(4). |
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| 作者姓名： | 朱术会 邹秉杰 武海萍 马寅姣 陈颖 周国华 |
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| 作者单位： | 1. 中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009
2. 中国药科大学生命科学与技术学院,南京,210009;华东医学生物技术研究所,南京,210002 |
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| 基金项目： | 江苏省科技支撑计划课题资助 |
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| 摘 要： | 新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。
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| 关 键 词： | 生物素化荧光素酶 大规模焦测序 生物素羧基载体蛋白 |
Preparation of Thermostable Biotinlyted Firefly Luciferase and Its Application to Pyrosequencing |
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| ZHU Shu-Hui,ZOU Bing-Jie,WU Hai-Ping,MA Yin-Jiao,CHEN Ying,ZHOU Guo-Hua.Preparation of Thermostable Biotinlyted Firefly Luciferase and Its Application to Pyrosequencing[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2010,38(4). |
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| Authors: | ZHU Shu-Hui ZOU Bing-Jie WU Hai-Ping MA Yin-Jiao CHEN Ying ZHOU Guo-Hua |
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