以酵母菌双杂合技术寻找志贺氏菌IpaH7.8作用蛋白质的目标蛋白

背景:志贺氏菌感染能造成人类出血性腹泻,此菌常带有一大型毒性质体,以携带第三型分泌系统及相关致病基因,并透过此系统释放作用蛋白,协助菌体侵入人类肠壁细胞,操控细胞功能,以利在细胞中存活及增殖.IpaH家族蛋白是作用蛋白中较特别的一群,志贺氏菌常带有数个IpaH家族基因,除了在毒性质体上,经常同时存在染色体上.从蛋白质结构上来说,IpaH家族蛋白皆由两个功能性区域组成,其C端均为E3泛素连接酶,而N端在不同IpaH家族蛋白则具有不同的白氨酸重复序列,可能结合不同的目标蛋白,最后将其泛素化.其中IpaH4.5、IpaH7.8、IpaH9.8在侵入宿主细胞后才释放:目前已有研究发现IpaH4.5和IpaH9.8的目标蛋白,其他IpaH蛋白的目标蛋白和功能则仍未知,因此我们希望利用酵母菌双杂合技术找出IpaH7.8的目标蛋白.方法:使用酵母菌双杂合系统筛选,接着将可能的候选蛋白,以其在细胞内的分布、伪阳性的可能性、与IpaH7.8交互作用的强度等,作进一步评估,最后以共同沉淀技术进行验证.结果:经酵母菌双杂合系统筛选后,我们得到6个候选蛋白,其中多数参与细胞的代谢反应.其中一候选蛋白-RAD50,主要分布在细胞核,而我们直接在细胞中表现IpaH7.8 N端和绿色萤光蛋白的融合蛋白,也发现绿色萤光聚集在细胞核,因此推测RAD50为候选蛋白的可能性最高.将IpaH7.8和RAD50进行共同沉淀,显示两者在生物体外的条件下可互相结合.