| 腈水合酶在大肠杆菌中的表达纯化 |
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| 引用本文： | 周全伟,黄伟波,黎常宏,王筱兰.腈水合酶在大肠杆菌中的表达纯化[J].江西科学,2010,28(1):45-50. |
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| 作者姓名： | 周全伟 黄伟波 黎常宏 王筱兰 |
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| 作者单位： | 1. 江西师范大学生命科学学院,江西,南昌,330022
2. 昌九农科化工有限公司,江西,南昌,330022 |
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| 摘 要： | 微生物的腈水合酶是催化丙烯腈生成丙烯酰胺的重要生物催化剂,广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。通过PCR扩增得到诺卡氏菌的腈水合酶基因。实验先构建得到BL21-pGEX-4T-1/NHase重组菌,表达GST-NHase融合蛋白。由于GST的相对分子质量较大,阻碍了腈水合酶的β亚基与α亚基的正确结合,从而使腈水合酶表现不出酶活。于是又构建了BL21-pET-30c/NHase重组菌,IPTG诱导表达结果显示,腈水合酶α亚基基本没有得到表达,影响了腈水合酶的活性。经生物信息学分析发现,腈水合酶α亚基的起始密码子为gtg,可能不易被大肠杆菌的RNA聚合酶识别,于是通过点突变将gtg替换成atg,阳性重组子经IPTG诱导表达,结果显示腈水合酶β亚基和α亚基的表达量都有所提高。诱导表达的菌液经超声破碎,离心得到粗酶液,用EPI-30-ARG-IDA-Co2+亲和载体纯化带6×His tag的腈水合酶,气相色谱法检测腈水合酶的酶活达到200 U/mL。
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| 关 键 词： | 诺卡氏菌 腈水合酶 重组质粒 诱导表达 |
Expression and Purification of Nitrile Hydratase Gene in Escherichia coli |
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| ZHOU Quan-wei,HUANG Wei-bo,LI Chang-hong,WANG Xiao-lan.Expression and Purification of Nitrile Hydratase Gene in Escherichia coli[J].Jiangxi Science,2010,28(1):45-50. |
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| Authors: | ZHOU Quan-wei HUANG Wei-bo LI Chang-hong WANG Xiao-lan |
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| Institution: | 1.College of Life Science/a>;Jiangxi Normal University/a>;Jiangxi Nanchang 330022 PRC/a>;2.Jiangxi Changjiu Chemical Limited Liability Company/a>;Jiangxi Nanchang 330022 PRC |
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| Abstract: | 微生物的腈水合酶是催化丙烯腈生成丙烯酰胺的重要生物催化剂,广泛应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。通过PCR扩增得到诺卡氏菌的腈水合酶基因。实验先构建得到BL21-pGEX-4T-1/NHase重组菌,表达GST-NHase融合蛋白。由于GST的相对分子质量较大,阻碍了腈水合酶的β亚基与α亚基的正确结合,从而使腈水合酶表现不出酶活。于是又构建了BL21-pET-30c/NHase重组菌,IPTG诱导表达结果显示,腈水合酶α亚基基本没有得到表达,影响了腈水合酶的活性。经生物信息学分析发现,腈水合酶α亚基的起始密码子为gtg,可能不易被大肠杆菌的RNA聚合酶识别,于是通过点突变将gtg替换成atg,阳性重组子经IPTG诱导表达,结果显示腈水合酶β亚基和α亚基的表达量都有所提高。诱导表达的菌液经超声破碎,离心得到粗酶液,用EPI-30-ARG-IDA-Co2+亲和载体纯化带6×His tag的腈水合酶,气相色谱法检测腈水合酶的酶活达到200 U/mL。 |
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| Keywords: | Nocardia sp Nitrile hydratase Recombinant plasmid Induced expression |
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