MALDI-TOF-MS法对重组人内皮抑素蛋白分子质量测定

肿瘤的生长依赖于血管的生成,新生血管不仅为肿瘤生长提供必需的营养物质,而且为肿瘤细胞扩散提供了重要的途径。1997年哈佛大学的O'Reilly等发现了一种内源性新血管生成抑制因子内皮抑素(Endoscatin),显示出特异抑制激活的血管内皮细胞增殖和肿瘤新血管生成的生物学活性,其抗肿瘤作用具有高效、低毒、无耐药性的优点。目前,内皮抑素的研究引起了国内外广泛的兴趣,在美国已进行以安全性为目的的I期临床实验,国内也有多家公司对内皮抑素进行了抗肿瘤研究并申报一类新药。内皮抑素有望成为医治肿瘤而又没有化疗和放疗的毒副作用的一种新的治疗方法,但是否能作为药物应用于临床,尚需对内皮抑素的结构特点及抑制肿瘤和内皮细胞的作用机制等方面进行许多深入的研究。     

稀土离子对重组内皮抑素与肝素相互作用的影响

通过荧光光谱法和圆二色谱法研究了重组内皮抑素与稀土离子和肝素的作用.结果表明,稀土离子和肝素都可以与重组内皮抑素结合并引起蛋白的荧光猝灭和二级结构的改变,稀土离子与重组内皮抑素的结合会影响其与肝素的相互作用,并降低重组内皮抑素对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制活性.     

重组内皮抑素的性质表征与生物活性分析

通过SDS—PAGE电泳、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、高效液相色谱、地高辛方法、蛋白印迹方法、鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和透射电子显微镜法对重组内皮抑素进行纯度分析、鉴定和生物活性研究。重组内皮抑素纯度达到99％，能够抑制鸡胚尿囊膜新血管生成和人脐静脉内皮细胞ECV304增殖，引发内皮细胞的凋亡。     

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F＇中,提取质粒测序,证实序列正确.再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋自在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达.     

内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析

采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPICgK，获得的重组质粒pPIC9K-EDN转化毕节酵母GSll5，构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastoris GSll5(pPIC9K-EDN)。SDS-PAGE分析结果显示：人内皮细胞抑制素在重组酵母GSll5(pPIC9K-EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵，经甲醇诱导48h，生物量达到250OD，分泌量为150mg/L，发酵液经SP Streamline，SP Sepharose FF阳离子交换柱和SephamseHeparin Hi Trap柱纯化，产物纯度达到98％。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。     

重组内皮抑素的质谱分析及对内皮细胞周期的影响

采用质谱、圆二色谱、荧光光谱与细胞周期分析技术研究了重组内皮抑素的蛋白结构和对内皮细胞的作用机制.研究发现,以包涵体方式表达的蛋白中会有未被降解的N末端甲硫氨酸产物,重组内皮抑素在G₂期阻断内皮细胞的生长.表明内皮抑素引发内皮细胞凋亡与细胞周期相关,为抗血管生成治疗肿瘤研究奠定了实验基础.     

定点突变内皮抑素Zn2+的结合位点及突变基因的克隆表达

从人胚肝组织中提取总RNA, 以逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法获得人内皮抑素编码序列, 采用定点突变技术将His2和His4双突变为Leu2和Val4. 将突变基因cDNA插入含有T7启动子的质粒pET-28b中构建表达质粒pMendo, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选表达菌株BL21-Mute, 表达菌株经IPTG诱导后以包涵体方式产生大量内皮抑素突变蛋白. SDS-PAGE分析表明, 表达的重组蛋白占菌株可溶性蛋白质的30%. 复性、 纯化的内皮抑素突变蛋白纯度达到98%, 失去抑制人脐静脉内皮细胞增殖的活性.     

人endostatin基因重组逆转录病毒载体的构建及其在NIH3T3细胞中表达

为探讨转人血管内皮抑制基因（endostatin）在转染细胞中的表达，利用逆转录病毒载体构建人endostatin基因的重组质粒，通过脂质体（lipofectamine）将重组质粒导入包装细胞PA317,制备重组病毒液。用重组病毒液感染NIH3T3细胞，经G418筛选获得转入endostatin基因细胞株NIH3T3-endo。同法制备对照细胞株NIH3T3-pLncx.PCR检测NIH3T3-endo细胞基因组，在扩增产物中一份550bp人endostatin基因特异性片段，对照组为阴性。免疫组化测定示仅NIH3T3-endo细胞中有外源性endostatin蛋白的表达，说明人endostatin基因已被成功导入NIH3T3细胞，并获得稳定表达。     

荧光光谱和圆二色谱研究重组内皮抑素与芦荟大黄素的相互作用

利用荧光光谱法和圆二色谱法研究了重组内皮抑素与中药有效成分芦荟大黄素的相互作用机制,求得两者在25℃和37℃的结合常数Ka为6.623×104和3.796×104。研究发现,Zn2+等5种金属离子能够竞争性降低重组内皮抑制与芦荟大黄素的结合常数,下降幅度为35%～55%,并且其影响程度随温度升高而增强。鸡胚尿囊膜血管生成实验结果表明,芦荟大黄素能增强重组内皮抑素的抗血管生成活性,使其对新生血管的抑制作用提高50%。     

血管内皮抑素的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

血管内皮抑素不仅能特异性地抑制血管内皮生长，而且对血管形成和肿瘤生长也具有强烈的抑制作用。利用PCR法从人胎肝cDNA文库中克隆了人血管内皮抑素的编码序列，构建了重组质粒pRSendo，并在E.coli中表达，SDS－PAGE表明其表达产物为包涵体，此外，还对血管内皮抑素做了初步的纯化。