长型肌球蛋白轻链激酶4Ig结构域的表达及单克隆抗体的制备

长型肌球蛋白轻链激酶(long myosin light chain kinase,L-MLCK)及其分子内结构域的功能还不清楚.在研究其功能时,特异性抗体是一基本工具,但目前国际上还没有制备成功特异性较好的抗体.为此,我们先在大肠杆菌E.coliBL21中重组表达了鸡L-MLCK的4Ig蛋白片段(MLCK4Ig),蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠.在小鼠血清中检测到特异性抗体的基础上,建立了2株杂交瘤细胞株,获得抗鸡MLCK4Ig的单克隆抗体.该抗体可以特异与鸡L-MLCK和鸡MLCK4Ig反应.本文并对该抗体的特性及应用进行了讨论.结果表明,我们部分解决了L-MLCK的抗体缺乏问题,为研究L-MLCK及MLCK4Ig片段的功能提供了重要工具.     

平滑肌肌球蛋白轻链激酶对肌球蛋白非Ca2 依赖性磷酸化(2)

为了初步揭示肌球蛋白轻链激酶(MLCK)对肌球蛋白(myosin)非Ca2 依赖性磷酸化的特征 试验方法采用10%甘油聚丙烯酰胺凝胶电泳检测myosin的磷酸化,用孔雀绿法测定myosin Mg2 -ATP酶活性及选择Scoin Image扫描软件分析所获得的数据。提出在MLCK参与的myosin活性调节中,myosin以非磷酸化、非Ca2 依赖性(CIPM)及Ca2 依赖性磷酸化(CDPM) 种状态存在 研究发现非Ca2 依赖性磷酸化myosin有以下特征:(1)耗能(Mg2 -ATP酶活性)高于非磷酸化myosin但低于Ca2 依赖性磷酸化myosin;(2)花生四烯酸(AA)可选择性加强myosin非Ca2 依赖性磷酸化;(3)在本试验条件下,未观察到MLCK抑制剂ML-9对非Ca2 依赖性myosin磷酸化的抑制作用;(4)组胺(histamine)对非Ca2 依赖性的抑制小于对Ca2 依赖性磷酸化的抑制,且这些差异在统计学上有显著性。以上结果提示myosin非Ca2 依赖性磷酸化不仅在程度上,而且在机制上与Ca2 依赖性磷酸化可能存在重要区别     

平滑肌肌球蛋白轻链激酶对肌球蛋白的非钙依赖性磷酸化

发现肌球蛋白轻链激酶(MLCK)不仅以钙依赖性的方式,同时也以非钙依赖性的方式参与对肌球蛋白轻链的磷酸化。该非钙依赖性磷酸化的特征是:需要高浓度,但受温度升高、反应时间延长、离子浓度升高的影响远小于钙依赖性磷酸化。研究结果提示肌球蛋白轻链激酶对肌球蛋白的非钙依赖性磷酸化可能是一种新的机制,并与平滑肌张力的维持有关。