Building of hFⅨ transgenic mice by spermatogenic cells

Human FⅨ expression vector pCMVⅨ was packaged by effectene^TM reagent and injected into mice seminiferous tubules with glass pipettes.The expressional frame of pCMVⅨ was examined by PCR and Southern blotting among 41 progenies.There were 2(4%) mice being integrated with hFⅨ gene into chromosomes.4.6ng/mL of hFⅨ protein was expressed in plasma of one mouse,which was tested by ELISA.We demonstrated that building of transgenic animals by spermatogonial stem cells is an efficient method.Meanwhile,it has also been proved to be an alternative choice for mammary gland bioreactor.     

凝血因子IX的体外检测方法研究

凝血因子ＩＸ的检测是血友病Ｂ基因治疗研究中的重要工作，在实验室原有基础上，发现和完善了凝血因子ＩＸ在蛋白质水平上的检测系统，为基因治疗血友病Ｂ提供了更为直观可靠的依据。首先，建立了以鼠抗人ＦＩＸ单克隆抗体Ａ－７为一抗的检测活性ＦＩＸ蛋白量的ＥＬＩＳＡ法，为检测活性ＦＩＸ提供了快速简便的方法。其次，实现了用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测转染细胞培养液上清中ＦＩＸ，确证了体外培养的转有人ＦＩＸｃＤＮＡ细     

国内科技期刊亮点

患有血友病的艾滋病患者可采用高效抗逆转录病毒治疗 一项6年的疗效评价分析研究表明,患有血友病的艾滋病患者可采用高效抗逆转录病毒治疗（HAART）,不但可以控制HIV复制和恢复免疫细胞．而且不会对血友病患者的出血状况、关节功能和体能造成不良影响.     

Expression of human clotting factor Ⅸ mediated by recom- binant lentiviral vector in cultured cells and hemophilia B mice

To explore the expression of human clotting factor Ⅸ (hFⅨ) cDNA in vitro and the feasibility of gene therapy for hemophilia B mice mediated by recombinant lentiviral vector, a recombinant hFⅨ lentiviral vector driven by ubiquitin-C promoter, FUXW, and by ABP liver specific promoter, FAXW, was constructed respectively. Recombinant lentivirus was harvested from 293T cells by calcium phosphate-mediated transient cotransfection of three plasmids (transgene vector, CMV腞8.2, VSV-G). hFⅨ expression was detected in supernatant of 293T, BHK and L-02 cells infected with FUXW virus, whereas higher expression of hFⅨ levels (630 ng/106 cells/48 h) was detected only in L-02 cells infected with FAXW virus. Serum hFⅨ antigen was detected in all hemophilia B mice treated with FAXW virus by tail vein injection, an efficiency level of hFⅨ was observed (45 ng/mL, approximately 1% of normal human levels), the expression lasted for more than 60 d. The results indicated that HIV-based lentiviral vectors offer a promising approach to the gene therapy of hemophilia B.     

抗人凝血VIII因子的单克隆抗体制备及其鉴定

经凝胶过滤和亲和层析分离得到的人抗血友病A因子——VIII因子抗原VIII:CAg,在用一期法和火箭免疫电泳证实其纯度后,免疫Balb/c小鼠和包被免疫测定板。采用常规鼠杂交瘤技术经间接ELISA法筛选、克隆化得到四个稳定分泌抗VIII:C的单克隆抗体的细胞株,即DC8,DE4,DE7和DE8,腹水效价为1:1×10~4～1:1×10~5,一期法抑制反应表明,单克隆抗体对VIII:C活性有显著的抑制作用,但其抑制是不完全的,对抗体进行了纯化及分析,并将单抗用于血友病A多态性的分析。     

双抗体夹心ELISA法测定人凝血因子IX蛋白

用双抗体夹心ELISA法测定人凝血因子IX蛋白。在转入了外源人凝血因子IX基因的CHO细胞和HSF细胞的培养液中均测得一定量的IX因子蛋白,其量相当于正常人血浆IX因子蛋白的0.89%～3.81%,而对照细胞均为阴性结果。对一例血友病B患者(IX:C<0.1%)的分析结果表明,其血浆中含有的IX因子蛋白量相当于正常人的52.3%,因而将此病例归属于血友病B~R型。本法灵敏度高、特异性强、重复性好,可与一期法相互补充,应用于临床血友病B的诊断、分类、家系分析及携带者的检出。     

人凝血因子ⅨcDNA离体表达调控的研究

构建了带有人ｈＦⅨ ｃＤＮＡ及不同调控顺序的重组质粒和反转录病毒载体，系统比较了不同启动子，增强子在不同靶细胞中对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ表达的作用，ＭｏＭＬＶ病毒的ＬＴＲ启动子在小鼠成纤维细胞中控制转录能力较强，还研究了ｈＦⅨ基因自身内含子Ⅰ及ＩＬ－２基因内含子对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ的表达增强艇，并就双启子和选择基因对ｈＦⅨ ｃＤＮＡ表达的影响进行了实验探讨。     

四例血友病B患者基因治疗的临床试验

报道了对四例血友病Ｂ患者基因治疗的临床试验，取自四例血友病Ｂ患者的自体皮肤成纤维细胞，通过反转录病毒介导的基因转移，能高效地分泌人凝血因子Ⅸ。用胶原包埋经遗传修饰的自体皮肤成纤维细胞，再移植到血友病Ｂ患者皮下。四例患者经治疗后，自发出血症状得到了减轻，血浆中凝血因子Ⅸ蛋白浓度和凝血活性明显地增加，其中两例患者增加较大，达到正常值的４％￣５％。另外两例患者体内的凝血因子Ⅸ和凝血活性也有不同程度的提高     

单基因遗传疾病的基因疗法

基因疗法是全球突破性技术之一,在单基因遗传疾病治疗中已取得突破性进展。阐述了不同的基因疗法策略、载体和基因编辑技术的特点,综述了脊髓性肌萎缩症、Leber先天性黑蒙2型、血友病、β-地中海贫血的发病机理、临床表现、基因疗法的开发进程以及临床试验情况。目前,上述4种单基因疾病的9种基因疗法已分别取得美国食品药品监督管理局突破性疗法资格、欧洲药品管理局的优先药物资格或者已经批准上市。基因疗法的研究还面临着许多挑战,但随着科学研究的深入和科学技术的不断发展,将有更多的患者获得治疗。     

凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠遗传稳定性及其临床表型研究

通过对凝血因子Ⅸ基因剔除小鼠遗传稳定性及其相应临床表型的研究,为以该动物模型为研究对象的血友病Ｂ基因治疗提供相应背景资料,遗传分析表明,该小鼠繁殖过程中无回复突变出现,亦未发现Ⅸ因子基因未敲除部分被转录的证据;血浆ＰＴ,ＫＰＴＴ和Ⅸ因子活性检定结果提示该小鼠符合人血友病Ｂ相应临床表征。