GATA-3启动子报告基因载体构建及其活性鉴定

目的转录因子GATA-3在人乳腺癌的发生发展中扮演重要的角色,研究其转录调控有重要意义.方法从人乳腺癌细胞系MCF-7提取基因组DNA为模板,以PCR方法扩增获得GATA-3启动子序列,将片段克隆到pGL3-Basic载体内,鉴定后通过报告基因检测系统检测GATA-3启动子报告基因的荧光素酶活性.结果双酶切、基因测序鉴定结果显示,成功构建了GATA-3启动子报告基因,并在MCF-7细胞内鉴定了其具有荧光素酶的表达活性.结论本实验成功构建了GATA-3启动子报告基因载体pGL3-GATA-3pro-Luc,为后续GATA-3在乳腺癌中表达及其调控通路以及以GATA-3为靶标的抗肿瘤药物研究提供了有效工具.     

基于p53通路探索芳基喹啉的抗结肠癌活性

肿瘤蛋白53(p53)是一种转录因子,调控多种类型的细胞应激响应,与肿瘤的发生发展预后密切相关,探索p53对药物刺激的响应,为抗肿瘤药物研究提供了一种思路。文章通过构建p53荧光素酶报告基因系统,以结肠癌细胞为模式细胞,建立基于p53信号通路的抗结肠癌药物筛选模型,从6-取代芳基-2-甲氧基喹啉类衍生物3a-3s中发现最优抗结肠癌化合物3i。作用机制研究显示,3i诱导DNA损伤,引起p53表达升高,诱导细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用。此外,p53功能缺陷引起结肠癌细胞对3i的耐药性。     

MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 调控 ${\bf Beclin}$ 1 启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因, 调控自噬起始和自噬体成熟. 在肌肉分化过程中, Beclin 1 基因表达上调, 自噬增加; 此外 MEK5-ERK5 信号活化并调控成肌细胞分化. 因此, 在肌肉分化过程中, MEK5-ERK5 信号通路可能调控 Beclin 1 基因表达. 目的是阐明 MEK5 对成肌细胞 Beclin 1 基因启动子活性的调控. 将不同长度 Beclin 1 启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12. 双荧光素酶报告基因检测实验结果显示, 含 Beclin 1 基因起始密码子上游 586 碱基对 DNA 片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性. MEK5$\alpha $显著增加 p-354 荧光素酶活性, 并有剂量依赖性; 而 MEK5$\beta $ 显著降低 p-354 荧光素酶活性. MEK5$\beta $能够拮抗 MEK5$\alpha $对 p-354 荧光素酶活性的调控. 与 MEK5 对 Beclin 1 基因启动子调控结果一致, MEK5$\alpha $CA 上调细胞Beclin 1 mRNA 表达, MEK5$\beta $DD 下调 Beclin 1 mRNA 表达, 并且 MEK5$\beta $DD 抑制 MEK5$\alpha $CA 对 Beclin 1 mRNA 表达的促进作用. 此外, 转录因子 CREB 家族成员 CREB3, CREBP 和 CREBL1 能够显著上调 p-354 荧光素酶活性. CREB3 呈剂量依赖性显著上调 p-354 荧光素酶活性, 并与 MEK5$\alpha $ 具有协同效应. MEK5$\alpha $ 和 MEK5$\beta $ 对 Beclin 1 启动子具有不同调控作用, CREB 可能是其下游效应因子.     

双荧光素酶报告基因系统的应用研究进展

双报告基因即在一个信号系统内同时表达,但独立测量的两个荧光酶的报告基因。在双报告基因系统中,一个报告基因活性的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而另个报告基因的组成型活性则提供内对照,使实验值正态化。目前很多实验都采用了荧光素酶报告基因(Luc),但从检测速度、灵敏度和线性范围来考虑,双荧光素酶即萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Renilla luciferase)的组合,可以较好地体现检测结果的精确性。本文以萤火虫双荧光素酶报告基因系统为重点,综述了该报告系统的特点、应用和近年来的研究进展。     

虫荧光素酶报告基因用于二噁英类化学物质的检测

虫萤光素酶报告基因检测二英类化学物质与传统的EROD法比较 ,灵敏度及线性范围均优于EROD法 ,并且检测时间缩短 ,操作简便。适合大量样本的快速筛选及半定量检测     

胰升血糖素样肽-1受体激动剂高通量筛选细胞模型研究

为建立GLP-1受体激动剂的高通量筛选方法,将GLP-1受体质粒和报告基因质粒(3×CRE/3×MRE/SRE-LUC/pGL3)按照1∶5的比例共转染到CHO细胞中,建立GLP-1受体激动剂筛选细胞株。利用GLP-1内源激动剂探索和优化每孔细胞接种密度、荧光素酶表达时间、Bright-GloTM试剂用量、DMSO浓度等筛选条件,建立可靠的筛选方法。当细胞数目为4×104个/孔,激动剂孵育时间为8 h,Bright-GloTM试剂4倍稀释,每孔DMSO终质量分数小于1%时,系统Z′-因子为0.75。利用此模型对中药提取物库进行检测,发现有5个样品显示出活性。结果表明,该模型能够用于GLP-1受体激动剂的高通量筛选。     

虫荧光素酶报告基因用于二恶英类化学物质的检测

虫萤光素酶报告基因检测二恶英类化学物质与传统的EROD法比较,灵敏度及线性范围均优于EROD法,并且检测时间缩短,操作简便。适合大量样本的快速筛选及半定量检测。     

利用报告基因表达系统快速鉴定骨诱导活性材料

通过构建真核表达质粒,使增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)报告基因的表达受骨形成相关转录因子Cbfa1基因启动子的调控,再用该质粒转染大鼠成肌细胞L6,建立稳定细胞株.在成骨培养基中诱导培养后,该细胞株呈现较明显的绿色荧光,表明细胞在经诱导的成骨分化过程中,Cbfa1基因表达增强,Cbfa1启动子驱动了EGFP的表达.将该细胞株接种到有较强骨诱导活性的羟基磷灰石/磷酸三钙(hydroxyapatitetricalcium phospha     

不需酶切位点的重叠延伸PCR在克隆表达中的应用

利用一种不需要酶切位点的重叠延伸PCR方法,将目的内含子片段插入LacZ报告基因中的任意位点,并对插入内含子片段的LacZ报告基因的活性进行分析,同时利用RT-PCR的方法对插入内含子的剪切效率进行检测。结果显示该方法可以在不加入额外碱基的情况下在DNA序列的特定位置插入目的DNA片段。并且该方法与In-Fusion克隆相比有一定的优越性。     

Pax5启动子的克隆及其在人淋巴瘤细胞系HL-60中转录因子的确定

克隆Pax5基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并检测其活性;采用PCR技术从人淋巴瘤细胞系HL-60基因组中扩增出Pax5启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,确定所扩增的DNA序列,在293T细胞中检测其活性;测序结果表明扩增的Pax5启动子序列正确,活性实验表明构建的报告基因具有启动子活性,转录因子SP1和Runx1能以剂量依赖的方式提高Pax5报告基因的转录活性;克隆了Pax5启动子,并发现转录因子SP1和Runx1能够调控Pax5的转录。