慈菇蛋白酶抑制剂的抑制特性及其活性中心的探讨

本文采用亲和层析分离纯化了结晶慈菇蛋白酶抑制剂A和B,抑制剂A和B均为双头多功能蛋白酶抑制剂,抑制剂A能同时等当量抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,对激肽释放酶的抑制作用较弱,抑制剂B能当量抑制2克分子的胰蛋白酶,对激肽释放酶的抑制活力高于抑制剂A,但对胰凝乳蛋白酶的抑制作用远比抑制剂A弱。化学修饰以及胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶对抑制剂A的竞争性结合表明:抑制剂A和B的两个活性中心均为Lys和Arg残基,其中Lys活性中心专一抑制胰蛋白酶,而由Arg活性中心构成的活性区域则表现为多功能,能抑制多种蛋白酶,从抑制剂A和B的结构特征推测,两活性中心应分别为Lys-Ser(44—45)及Arg-Tyr-Lys(76—78),在抑制剂A中还存在一疏水性残基参与对胰凝乳蛋白酶的抑制,此残基位于由Arg活性中心所构成的活性区域中。     

川贝母与易混品的鉴别

其易混品种如光慈菇、一轮贝母及丽江山慈菇等，它们的来源、外观主要性状特点，显微主要特征、成分及理化反应与正品川贝母完全不同，不可混用，本文着重论述其生药学对比鉴别，为识别川贝母的真伪，提供了参考依据。     

慈菇中抗真菌蛋白分离纯化初步研究

植物在长期进化过程中,形成了一套天然的防御系统。其中植物抗真菌蛋白(antifungal protein,AFP)是主要成员之一,它对多种植物和人体病原真菌生长有抑制作用。本研究以慈菇(Sagittaria sagittifolia)块茎为材料,运用阳离子交换层析和葡聚糖G50凝胶过滤层析技术,结合活性追踪法,对慈菇中的抗真菌蛋白进行了初步分离纯化。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明,纯化的抗真菌蛋白并不是单一的组分,至少有3个电泳条带,分子量集中在14.4~20.1 kD之间。纯化的抗真菌蛋白对烟草赤星病菌(Alternari alternata)的菌丝生长具有较明显抑制作用。     

慈菇蛋白酶抑制剂的一级结构

慈菇蛋白酶抑制剂A和B经硫硫键还原及羧甲基化后,分别用内肽酶及溴化氰裂解,肽段经分离纯化后在气相蛋白质序列仪上进行序列分析,通过重叠肽段的拼接,阐明了全部一级结构.慈菇抑制剂A和B均由150个氨基酸残基组成,含有三对硫硫键.两者在结构上有91％的同源性,但与其它已知结构的丝氨酸蛋白酶抑制剂有明显不同.因而它是属于新的一族抑制剂.根据两者的结构特征.推测它们的活性中心均为Lys-Ser(44—45)和Arg-Tyr-Lys(77—79).在抑制剂A,B 13个残基差异中,其中第87位残基由Leu置换为Arg.这可能是引起两者抑制特性差异的主要原因.     

新型双抗虫基因植物表达载体的构建及其在转基因烟草中的表达

用一个合成的编码完全活化的苏云金芽孢杆菌(Bt)Cry1Ac的嵌合蛋白基因BtS29K与慈菇蛋白酶抑制剂A和B的融合蛋白基因API-BA构建了双抗虫基因植物表达载体pBS29K-BA.通过农杆菌介导法将该双抗虫基因转入烟草,获得了一批可同时表达两个抗虫蛋白的转基因植株.Western blot分析结果表明Cry1Ac和API-BA蛋白的表达量分别达到3.2μg/g鲜叶重和4.9μg/g鲜叶重.用棉铃虫进行的杀虫试验表明,在中～高抗虫(70%以上的昆虫死亡率)植株中,表达双抗虫基因的植株百分数较仅表达Bt基因的高10%,比仅表达API-BA的高25%.证明用完全活化的Bt蛋白编码序列与蛋白酶抑制剂基因构建双抗虫基因表达载体可以确保两个基因抗虫功能的充分发挥.