利用蛋白质组学技术筛选与BIV基质蛋白MA相互作用蛋白

牛免疫缺陷病毒BIV的基质蛋白MA是由gag基因编码病毒结构蛋白之一,参与病毒运输包装等多种过程.通过蛋白质组学方法,寻找与MA有相互作用的宿主蛋白.通过原核表达MA-CBP融合蛋白,将其结合在几丁质上,并与细胞裂解物混合,纯化特异结合的细胞蛋白.利用双向电泳以及MALDI-TOF质谱分析,筛选到8个与MA具有相互作用的候选蛋白,功能涉及运输、氧化还原、热激反应等.进而克隆所鉴定蛋白之一的PRDX4,利用体外结合实验进一步证实其与BIV MA蛋白存在相互作用.初步建立利用蛋白质组学技术研究病毒与宿主相互作用实验方法,所得结果为了解慢病毒结构蛋白在病毒生活周期中功能提供了线索,有助于探索过氧化物酶家族蛋白在病毒感染过程中的作用及其分子机制.     

尿样中核基质蛋白22的免疫电化学生物传感器研制

将(4,4',4',4')四羧基酞菁钴(CoTcPc)和HRP标记核基质蛋白22抗体(HRP-Ab-NMP22)一起固定在Au电极表面,构建了一种快速测定膀胱肿瘤患者尿液中NMP22抗原含量的安培免疫传感器(HRP-Ab-NMP22/Fe3O4/CoPc CME).实验表明:该传感器对NMP22抗原具有良好的电化学响应,HRP对H2O2电催化氧化电流I0降低,△I0与NMP22浓度在1.0～150ng·mL-1成线性关系,检测限则为0.5ng·mL-1.该传感器基于一次性竞争性免疫反应,较Elisa法提高了检测速度,有望用于膀胱肿瘤的迅速诊断.     

HMBA诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中核基质蛋白表达变化

应用选择性抽提、双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析5mmol/LHMBA诱导处理前后人成骨肉瘤MG 63细胞核基质蛋白表达变化,鉴定与人成骨肉瘤细胞增殖分化相关的特异核基质蛋白.实验结果显示在HMBA诱导处理MG 63细胞分化过程中,核基质蛋白NMP 1、NMP 2、NMP 3、NMP 4、NMP 5、NMP 6和NMP 7等7个蛋白点表达发生显著变化.其中NMP 1仅在MG 63细胞中表达,NMP 6则为经HMBA诱导处理后新出现的蛋白质,NMP 2、NMP 7在HMBA诱导分化细胞中表达减弱,而NMP 3、NMP 4和NMP 5则在诱导分化后细胞中表达增强.首次表明在人成骨肉瘤MG 63细胞诱导分化过程中伴有核基质蛋白表达的差异,证实了与肿瘤细胞增殖分化相关的特异核基质蛋白的存在.这对于揭示核基质蛋白与细胞癌变和逆转的关系、阐明细胞增殖分化的基因表达调控原理,均具有重要意义.     

维甲酸诱导人成骨肉瘤MG-63细胞分化过程中核基质构型及其蛋白质组成变化观察

应用选择性抽提、整装透射电镜观察和双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析维甲酸诱导处理前后人成骨肉瘤MG-63细胞核基质-中间纤维系统的构型变化，以及核基质蛋白表达变化．实验结果显示MG-63细胞核基质和中间纤维数景较少、分布不均匀，核纤层为薄厚不一结构，与两类纤维联系不密切．经1μmol／L维甲酸处理后，细胞核基质纤维和中间纤维数量增多、结构层次丰富、单丝成分多，分布均匀并相互交织成规则网络，两类纤维通过薄层均一的核纤层发生密切联系，形成贯穿整个细胞核质区域的完整体系．此外，核基质蛋白表达也发生显著变化．表明经维甲酸诱导处理后MG-63的核基质-中间纤维系统产生了与正常细胞相似的恢复性改变，并且伴有核基质蛋白表达的差异．这些变化是癌细胞恶性表型逆转的重要特征和功能表现，对于揭示核基质构型及其蛋白组成与细胞癌变和逆转的关系和阐明细胞增殖分化的基因表达调控原理，均具有重要意义．     

狂犬病病毒基质蛋白的真核表达及鉴定

本文设计并合成了狂犬病病毒PV株基质蛋白(matrixprotein,MP)基因与优化的PV株基质蛋白基因,分别克隆至转移载体pVL1393中构建穿梭质粒,再以穿梭质粒与线性化的杆状病毒BaculoGoldTM进行重组,构建表达MP的重组杆状病毒,然后感染Sf9昆虫细胞进行表达.通过SDS-PAGE电泳分析显示,表达的MP和优化后MP约分别为27kDa和26kDa.间接免疫荧光检测(IFA)显示,表达的MP和优化后MP均可与鼠抗His单克隆抗体及鼠抗RV血清特异性结合,出现明显的特异性绿色荧光.Western blot检测显示,表达的MP和优化后MP均可被鼠抗His单克隆抗体特异性识别.     

一种新型贝壳基质蛋白的重组表达与功能分析

贝壳是在贝壳基质蛋白的调控下形成的生物矿化产物,也是生物工程和生物材料学研究的重要对象。贝壳基质蛋白通过调控碳酸钙晶体的成核和生长过程,使贝壳形成有规则的纳米结构并赋予贝壳极强的力学性能。在厚壳贻贝肌棱柱层中鉴定到一种新型贝壳基质蛋白,因其富含谷氨酰胺而被命名为富含谷氨酰胺的贝壳蛋白（Glutamine-rich shell protein,GRSP),该蛋白序列中含18.2%的谷氨酰胺以及PDZ (Postsynaptic density/Discs large/Zonula occludens)和ZM (ZASP-like Motif)结构域。为了解GRSP在生物矿化过程中的分子机理,在序列分析的基础上,采用密码子优化结合原核重组表达策略,获得重组厚壳贻贝GRSP;进一步利用扫描电镜和傅里叶红外光谱,分析重组GRSP对方解石型以及文石型碳酸钙晶体在形貌和晶型方面的影响;同时,利用沉淀法分析重组GRSP对碳酸钙结晶速度的影响以及与碳酸钙晶体的结合作用。结果表明,重组GRSP可诱导文石型碳酸钙晶体发生形貌变化,并对方解石型碳酸钙晶型产生影响。此外,重组GRSP表现出与碳酸钙结合的活性并能抑制方解石型碳酸钙晶体的结晶速度。上述结果表明,GRSP蛋白可能对贝壳的形成及发育具有重要影响并在贝壳肌棱柱层的形成中发挥重要作用。     

尿核基质蛋白-22和液基细胞学在血尿患者膀胱癌筛查中的应用

目的探讨尿核基质蛋白-22和液基细胞学在血尿患者膀胱癌筛查中的应用。方法选取2015年6月至12月在兴宁市中医医院收集的10例膀胱癌疑似患者,分别进行尿核基质蛋白-22检查与尿液基细胞学检。观察两种检查下患者的诊断结果。结果尿核基质蛋白-22的敏感度为80.2%,液基细胞学的敏感度为72.1%,两组之间作比较差异有统计学意义(P0.05)。尿核基质蛋白的特异度为71.6%,液基细胞学的特异度为98.6%,两组之间比较差异具有统计学意义(P0.05)。两种检查下患者阳性预测率及阴性预测率比较,差异显著。结论在血尿患者的膀胱癌筛查中,尿核基质蛋白22作为诊断膀胱癌的新肿瘤标记物对患者创伤性较小,灵敏度和特异性较高的诊断方法。而尿液基细胞学与核基质蛋白22联合使用可以有效提高对膀胱癌诊断的敏感程度。     

一种新型贝壳基质蛋白的重组表达与功能分析

贝壳是在贝壳基质蛋白的调控下形成的生物矿化产物,也是生物工程和生物材料学研究的重要对象。贝壳基质蛋白通过调控碳酸钙晶体的成核和生长过程,使贝壳形成有规则的纳米结构并赋予贝壳极强的力学性能。在厚壳贻贝肌棱柱层中鉴定到一种新型贝壳基质蛋白,因其富含谷氨酰胺而被命名为富含谷氨酰胺的贝壳蛋白（Glutamine-rich shell protein,GRSP),该蛋白序列中含18.2%的谷氨酰胺以及PDZ (Postsynaptic density/Discs large/Zonula occludens)和ZM (ZASP-like Motif)结构域。为了解GRSP在生物矿化过程中的分子机理,在序列分析的基础上,采用密码子优化结合原核重组表达策略,获得重组厚壳贻贝GRSP;进一步利用扫描电镜和傅里叶红外光谱,分析重组GRSP对方解石型以及文石型碳酸钙晶体在形貌和晶型方面的影响;同时,利用沉淀法分析重组GRSP对碳酸钙结晶速度的影响以及与碳酸钙晶体的结合作用。结果表明,重组GRSP可诱导文石型碳酸钙晶体发生形貌变化,并对方解石型碳酸钙晶型产生影响。此外,重组GRSP表现出与碳酸钙结合的活性并能抑制方解石型碳酸钙晶体的结晶速度。上述结果表明,GRSP蛋白可能对贝壳的形成及发育具有重要影响并在贝壳肌棱柱层的形成中发挥重要作用。     

A型流感病毒基质蛋白M1的二聚化机制

流感病毒基质蛋白1(matrix protein 1,M1)位于病毒包膜之下,形成一层壳状结构(衣壳),可与病毒的血凝素、神经氨酸酶、包膜和病毒遗传物质发生相互作用,在病毒的组装与复制过程中起着关键作用.不过,除N端有晶体结构外,全长M1蛋白的结构尚未解析.因此,人们对全长M1蛋白如何二聚化、然后多聚化形成病毒衣壳的过程知之甚少.为了解M1蛋白的二聚化机制,首先从M1的N端片段晶体结构出发,用蛋白质结构预测方法获得M1的全长结构模型;其次,对可能的M1二聚体进行分子动力学模拟,分析其二聚化界面的氨基酸,由此发现了一种通过M1蛋白C端片段结合而形成的二聚体;最后,为验证模拟结果,用电镜三维重构方法分析了全长M1二聚体的构象,并提出了M1多聚化的机理模型.     

新城疫病毒HB 92株M基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR方法扩增了新城疫病毒(NDV)无毒耐热株(HB92株)M基因，将其克隆于pGEM-T载体，并进行了序列测定和分析．结果显示，测定的M基因长1223个核苷酸。包含一个1095个核苷酸的开放阅读框(ORF)，编码364个氨基酸．与已报道的10株NDVM基因比较，核苷酸同源性为88．4％～95．8％，氨基酸同源性为89．8％～95．3％。HB92株与V4株M基因核苷酸的同源性最高(达95．8％)．NDVM蛋白分子中有9对碱性氨基酸。在多肽的第117～120位有一个含4个氨基酸CKKS的特征性结构．这些结果为揭示NDV HB92株的分子生物学背景，了解NDV的分子进化和遗传变异机理，进而开发利用HB92株奠定了基础，也为将NDV另列为副粘病毒亚科的一个新属提供了理论支持．