重离子辐射提高腺病毒介导小鼠黑色素瘤细胞转染率的研究

探讨12C6+ 离子束辐射对用带有绿色荧光蛋白基因的缺陷性腺病毒（AdCMV GFP）转染小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞系)的影响。 采用不同剂量的12C6+ 重离子束辐射经AdCMV GFP 转染的B16细胞， 利用流式细胞仪检测腺病毒的转染率。 结果表明， 12C6＋重离子束辐射能提高腺病毒对B16细胞的转染率， 且具有量效关系。 此外， 先转染后辐射法比起先辐射后转染法能更显著地提高转染率。The effect of 12C6+ beam irradiation on AdCMV GFP (a replication deficient recombinant adenoviral vector containing CMV promoter and green fluorescent protein) gene transfection efficiency for murine melanoma cell B16 has been investigated. B16 cells infected with AdCMV GFP were irradiated by different doses of 12C6+ beam. The transfection efficiency was assessed by flow cytometry (FCM). Results show that 12C6+ beam irradiation can improve tansfection efficiency of AdCMV GFP on murine melanoma cell B16 in a dose dependent manner. In addition， the tansfection efficiency in pre tranfection plus irradiation group is higher than that in pre irradiation plus tranfection group at the same dose irradiation dose.     

腺病毒载体与肿瘤基因治疗

基因导入系统是恶性肿瘤基因治疗中急需解决的问题．由于腺病毒作为载体介导外源效应基因在肿瘤细胞中的高效表达,使其应用日趋增多．用于肿瘤基因治疗的腺病毒可分为复制缺陷型和复制型．常用的效应基因包括：抑癌基因,前药转换酶基因,核酶基因和细胞因子基因等     

辐射诱导促进AdCMV-p53 转染前列腺癌细胞

用腺病毒重组体（AdCMV p53/GFP）转染经0.5, 1.0和2.0 Gy γ射线辐射处理的前列腺癌细胞[PC 3（ nullp53）], 用克隆形成法检测细胞增殖能力, 用流式细胞分析法测定腺病毒重组体转染率和外源性p53蛋白表达。 结果提示, 辐射诱导使腺病毒重组体转染PC 3细胞提高7%—39%。 辐射联合 AdCMV p53 转染组p53表达水平提高18.5%—35.4%。 与单纯 AdCMV p53 转染组和单纯辐射组相比, 辐射联合 AdCMV-p53 转染组细胞存活率分别降低25%—64%和22%—65%。 To determine whether low dose pre irradiation could enhance adenovirus mediated p53 transfer and expression in human prostate adenocarcinoma, the PC 3 cells were pre exposed to γ rays, and then infected with replication deficient adenovirus recombinant vectors, containing human wild type p53 (AdCMV p53) or green fluorescent protein gene (AdCMV GFP) respectively (γ ray irradiation + AdCMV p53 /GFP infection). The exogenous gene transfer and expression were detected by flow cytometric analysis. The GFP transfer frequencies in γ irradiation + AdCMV GFP infection groups were 7%—39% more than those in AdCMV GFP infection groups. The p53 levels in the γ irradiation + AdCMV p53 infection groups were 18.5%—35.4% more than those in AdCMV p53 infection groups (p<0.05),suggesting that low dose (less than or equal to 1.0 Gy) irradiation could significantly promote exogenous p53 transfer and expression in the PC 3 cells. The survival fractions for the γ irradiation + AdCMV p53 infection groups were 25%—64%, 22%—65% less than those for AdCMV p53 infection, or γ irradiation groups, respectively (p<0.05).     

汉坦病毒嵌合基因G2S0.7与CTL多表位重组腺病毒的构建及免疫学分析

目的:构建含有汉坦病毒M基因(编码糖蛋白G2)和部分S基因(编码核蛋白主要抗原区段)以及S基因的多个CTL表位的多种蕈组腺病毒表达载体,并对这些重组腺病毒的免疫学特性进行研究.方法:构建含目的基因的重组腺病毒载体,并在VeroE6细胞中进行表达,利用纯化后的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过ELISA、微量细胞中和试验、T淋巴细胞增殖实验及CTL杀伤实验等方法检测免疫反应.结果:成功表达出可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G2的特异性单克隆抗体(mAb)所识别的融合蛋白;重组的腺病毒可以有效诱导针对汉坦病毒NP及GP的体液免疫应答和细胞免疫应答;同时我们发现含有CTL表位的重组腺病毒比不含CTL表位的重组腺病毒可以诱导小鼠产生更为有效的细胞免疫反应.结论:构建的含CTL多表位的重组腺病毒可以有效的提高嵌合基因刺激细胞免疫应答的能力.     

人IL-16基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并鉴定人白细胞介素16(IL-16)的重组腺病毒pAd-IL-16表达载体,为进一步研究IL-16功能奠定基础.方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),组胺刺激后提取总RNA,RT-PCR扩增IL-16基因,将其克隆到含有绿色荧光蛋白(GFP)标记的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV后,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAd-IL-16,转染 HEK 293T细胞包装病毒.荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光,测定病毒效价,RT-PCR和Western blot分别分析细胞内IL-16 mRNA和蛋白质的表达.结果:经双酶切及基因鉴定,重组穿梭质粒和重组腺病毒质粒均见约400 by插人片段,测序结果和GenBank中的基因序列一致;重组病毒效价为2.8×10～8 pfu/mL;重组病毒感染后,HEK 293T细胞中IL-16mRNA和蛋白质均有表达.结论:成功构建IL-16重组腺病毒载体,并可在HEK 293T细胞中表达,为进一步研究IL-16的功能奠定了基础.     

柯萨奇-腺病毒受体在扩张型心肌病患者外周血白细胞表面的表达及意义

目的观察柯萨奇-腺病毒受体（CAR）在扩张型心肌病（DCM）患者外周血白细胞表面的表达及意义。方法选择DCM患者50例作为观察组,同期选择30例正常体检者作为对照组。入选后分别采用流式细胞术（FCM）检测外周血白细胞表面CAR表达水平;RT- PCR技术测定柯萨奇B组病毒-核糖核酸（CVB- RNA）表达;ELISA法检测CVB抗体效价。在客观比较病毒检测方法的同时,分析CAR在DCM患者中的表达及意义并探讨FCM在临床病原学检测中的价值。结果（1）经FCM技术检测,观察组外周血白细胞表面CAR表达水平较对照组升高（P＜0.01）,观察组CVB- RNA阳性22例（44.0%）,对照组阳性6例（20.0%）,差异有统计学意义（P＜0.05）;观察组CVB抗体阳性32例（64.0%）,对照组阳性10例（33.3%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）CVB- RNA阳性者中外周血白细胞表面CAR表达水平较阴性者明显升高（P＜0.01）;22例CVB- RNA阳性者中CVB抗体全部阳性,而28例CVB- RNA阴性患者中CVB抗体阳性者亦有16例。结论外周血白细胞表面CAR高表达的DCM患者可能存在病毒持续感染;FCM技术检测白细胞表面CAR表达水平可以作为DCM患者病毒感染的定量指标。     

靶向性荧光探针在乳腺癌早期诊断中的应用

选用E1/E3缺失型腺病毒作为靶向探针的载体,用化学修饰法将叶酸共价偶联腺病毒衣壳蛋白以提高探针的靶向性,用荧光染料罗丹明B偶联叶酸修饰的腺病毒,制备叶酸-腺病毒-RB探针,在体外研究此探针的毒性和靶向性.用近红外荧光染料ICG共价结合叶酸修饰的腺病毒,合成叶酸-腺病毒-ICG探针,使用近红外成像技术在位实时监测探针在体内的靶向性.实验结果证明叶酸-腺病毒-RB和叶酸-腺病毒-近红外探针对正细胞毒性较小,对早期乳腺癌细胞/组织具有较好的靶向性.