激光诱导荧光毛细管电泳法优化随机寡核苷酸文库聚合酶链反应扩增的条件

寡核苷酸文库的聚合酶链反应(PCR)扩增是指数富集系统配基进化技术(SELEX)筛选适配子技术中的重要步骤.本研究采用毛细管电泳技术结合激光诱导荧光检测器(CE-LIF),通过对双链产物、PCR副产物以及剩余引物的考察,研究了寡核苷酸文库PCR扩增时的影响因素,并对其进行优化.结果表明,随机寡核苷酸文库的扩增与传统均一模板的扩增显著不同,其在扩增十几个循环时产物就达到最大值;此外,初始模板数、退火温度、DNA聚合酶浓度等条件也有所不同.因此, 在进行SELEX筛选之前必须对文库PCR条件进行详细优化.本研究中N39文库优化后的PCR扩增条件为:初始模板的量为105个分子,DNA聚合酶浓度0.05 U/μL,退火温度70 ℃,18个循环.本研究为利用SELEX技术有效筛选适配子,降低筛选的假阳性及提高特异性提供了参考依据.     

新疆两湖细菌的非培多样性研究

采用非培的方法对新疆销库尔成湖和兔子湖的细菌多样性进行研究,通过细菌的16SrDNA通用引物PCR扩增其16SrRNA基因序列并构建16SrDNA文库,每个湖随机抽取32个克隆子进行测序,借助系统发育分析软件对获得的序列进行分析;同时通过多样性指数、丰富度指数和优势度指数对两个湖的细菌多样性进行了比较分析．研究结果表明同销库尔成湖的细菌文库相似的微生物属于以下六大细菌类群：变形细菌门（Proteobacteria）34．5％,包括α-proteobacteria、β-proteobacteria和γ-proteobacteria三个纲,拟杆菌门（Bacteroidetes）27．6％,壁厚菌门（Firmicutes）24．1％,绿菌门（Chlorobi）3．4％,疣微菌门（Verrucomicrobia）3．4％和未分类细菌（unclassified）6．9％;而与兔子湖的细菌文库相似的微生物则分为以下七大类：变形细菌门（Proteobacteria）51．90％,包括β-proteobacteria、γ-proteobacteria和δ-proteobacteria,拟杆菌门（Bacteroidetes）7．40％、壁厚菌门（Firmicutes）22．2％、酸杆菌门（Acidobacteria）3．70％、放线菌门（Actinobacteria）3．70％、浮霉菌门（Planctomycetes）3．70％和未分类细菌（Unclassified）7．40％．最后两湖的各种多样性指数的比较结果表明兔子湖的细菌多样性和丰富度均比销库尔成湖大,这也充分显示了新疆地区的湖泊具有丰富的微生物多样性,值得进一步深入研究．     

人原发性肝癌中的转甲状腺素蛋白(Transthyretin)基因

本文从人正常肝对原发性肝癌的递减式cDNA文库(Subtracting cDNA libra-ry)中筛选出pG8cDNA克隆.Northem杂交证明它在正常肝中高度转录,而在9例肝癌中转录严重受阻遏.9例肝癌DNA MspI酶切杂交信号提示,4例肝癌中该基因存在部分DNA片段的丢失.在另7对肝癌及癌旁组织样本中,有4例肝癌中该基因同样存在部分片段丢失.cDNA序列分析证明它与转甲状腺素蛋白(Transthyretin,TTR)基因的编码区全部同源.本文首次报道了在人肝癌中TTR基因转录严重受阻遏及在基因结构上可能存在丢失或缺陷,提示TTR基因可能是人肝癌中基因缺陷的一个标记或抗癌基因之一.     

凡纳滨对虾兰尼定受体基因亚克隆文库的构建及部分序列的测定

将一个含有凡纳滨对虾兰尼定受体基因的fosmid克隆用DNA剪切仪进行片段化处理,回收3～5kb之间的DNA片段连接到pUC118HincⅡ/BAP载体上,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆文库.经鉴定,该文库滴度为5.0×104 cfu.mL-1,重组率达到90%,插入片段大小在3～5kb范围内.随机挑取100个阳性克隆进行两端测序,通过拼接得到一条兰尼定受体基因部分片段,该片段长2 550bp.通过比对分析,发现该基因片段推导的氨基酸序列与果蝇兰尼定受体基因有较高的相似性.     

凡纳滨对虾基因组fosmid文库的构建及钙离子通道基因的筛选

本研究构建了凡纳滨对虾的基因组fosmid文库,该文库包含大约1.1×105个克隆,插入片段平均长度大于35 kb.根据和果蝇钙离子通道基因同源的凡纳滨对虾EST序列设计引物,对文库进行了PCR筛选,得到1个阳性克隆,测序结果显示该克隆包含有钙离子通道基因.研究结果为凡纳滨对虾的基因克隆和分子选育等研究奠定了基础.     

人16周胎儿脑cDNA文库的构建及鉴定

本文从 16周的胎儿脑中抽提总 m RNA,经过一系列酶促反应后合成 c DNA,分级分离柱除去小片段 DNA后克隆到λgt10载体中 ,转染宿主菌 C60 0 hfl,文库包装效率为 4 .2× 10 6pfu/μg,得到的原始克隆数为 2 .1× 10 6,c DNA插入片段平均大于 1.2 kpb.根据已知序列设计引物 ,从这个 c DNA文库中扩增出血管内皮生长因子 ( VEGF)的全长 c DNA基因     

结肠癌诱导分化基因表达差异的消减cDNA文库的建立

为保存和分析抑制性消减杂交 (SSH)获得的结肠癌经全反式维甲酸和 1 ,2 5-(OH) 2 D3联合诱导分化前、后的差异cDNA ,把消减产物与TA载体连接并转化到大肠杆菌中建立消减cDNA文库 .结果表明 :诱导前消减cDNA文库的容量为 1 .0 5× 1 0 4 pfu ,诱导后消减cDNA文库的容量为 1 .49× 1 0 4 pfu .本实验为进一步研究结肠癌的发病机制和诱导分化的机制提供了物质基础 .     

与Pi—2（t）基因连锁的栽培稻BAC克隆在药用野生稻和栽培稻中的比较物理定位

用栽培稻遗传图第6连锁群中与Pi-2(t)紧密连锁的RFLP标记RG64及其筛选出来的BAC克隆38D17作为探针,对药用野生稻和栽培稻进行荧光原位杂交(FISH),供试探针RG64及BAC克隆38D17均被定位于药用野生稻和栽培稻第6染色体.药用野生稻杂交信号的百分距离分别为44.87士5.33和46.50士4.57,而栽培稻则为35.85士3.06和36.05±2.44,信号检出率相应地为7.14%、42.53%、8.09%和40.78%.BAC克隆和RFLP探针杂交位置几乎一致,由此推知,与抗性基因Pi-2(t)连锁的BAC克隆在药用野生稻中的同源顺序就在第6染色体杂交信号出现的相应位置.在未封阻的情况下,药用野生稻多个染色体上具有信号,这表明它和栽培稻的Cot-IDNA重复序列在一定的程度上具有同源性.文中讨论了栽培稻BAC克隆对药用野生稻原位杂交物理作图的可行性和Cot-IDNA的制备所涉及的一些技术问题.     

云南紫稻细胞质雄性不育系和保持系线粒体基因组BAC文库的构建

以云南紫稻细胞质无花粉型水稻樱香不育系和保持系为材料,构建了不育系和保持系的线粒体基因组BAC文库.每个文库均保存2 304个菌落,外源插入片段介于10～20 kb之间.将两个文库的2 304个克隆分别集中于96孔板中,根据已发表的水稻线粒体序列对atp6、atp9、cob、cox2等4个基因设计特定引物,对96孔板中的菌落进行了PCR鉴定,均能筛选得到阳性克隆,通过对96孔板中阳性克隆的位置进行推导,可以得到文库中含有相应基因克隆的大致位置及数目.PCR筛选结果显示两个文库均包含用于检测的目的线粒体基因,说明文库典型性良好,并且PCR法用于文库基因筛选具有快速简便的优点.     

生物荧光传感器检测环境水样中氨基甲酸酯类农药残留

建立了简便、灵敏的氨基甲酸酯类农药生物荧光传感器及其检测方法。通过构建氨基甲酸酯类农药降解菌H5基因组文库,筛选出氨基甲酸酯类农药特异性响应功能基因的调控序列,将其与增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)连接,构建了非细胞体系生物荧光传感器H12-E,非细胞体系蛋白浓度为1.0 g/L。在室温条件下,对不同浓度呋喃丹标准液进行检测,30 min即可检测出fg级氨基甲酸酯类农药总量,灵敏度高于国家标准,线性范围1×10!9~1×10!4g/L。采集吉林省松花江流域等水样,检测氨基甲酸酯类农药残留,并向伊通河水样中添加高中低3个水平呋喃丹标准液,方法回收率95%~110%,相对标准偏差(RSD)2.4%~4.9%。本方法可望用于环境水体中氨基甲酸酯类农药残留的快速检测。