杂交瘤细胞的无血清低蛋白培养

实现了杂交瘤细胞的体外无血清低蛋白培养。考察了血清浓度、基础培养基和接种密度对细胞生长的影响。在含5%血清培养基、1%血清培养基和无血清低蛋白培养基中适应生长的细胞,μ分别为0.68、0.45、0.44d-1,qGlc分别为13.4×10-9、13.1×10-9、19.2×10-9mmol/(cell·分别为39.4×10-9、44.1×10-9、37.7×10-9mg/(cell·d),YMAb/Xv分别为52.6×10-9、d),qMAb57.8×10-9、54.4×10-9mg/cell,YLac/Glc分别为2.0、1.95、2.0mmol/mmol。无血清培养中葡萄糖代谢途径不变,参与细胞维持代谢的葡萄糖比例增大。血清浓度降低,延迟期变长,最大活细胞密度下降。基础培养基影响细胞的最大活细胞密度,不影响生长速率。无血清培养基中细胞的接种密度选择在0.2×106～0.3×106cells/mL。     

底物限制对杂交瘤细胞生长、代谢和单抗生成的影响

考察了葡萄糖或谷氨酰胺限制的批培养中杂交瘤细胞的生长、代谢和单抗生成。葡萄糖或谷氨酰胺限制时最大活细胞密度基本相同,为(1.0±0.1)×106cells/mL。葡萄糖限制时,乳酸生成减少,YLac/Glc降低,YCell/Glc增加,提示葡萄糖更多地参与三羧酸循环。谷氨酰胺限制时,氨和丙氨酸生成减少,YAmm/Gln增加,YAla/Gln减小,提示谷氨酰胺的能量利用率提高。谷氨酰胺缺失时异亮氨酸、亮氨酸、胱氨酸、缬氨酸、色氨酸、组氨酸等替代谷氨酰胺,维持细胞生长和单抗合成,产物是甘氨酸和天冬氨酸。单抗生成与细胞生长关联,并且细胞停止生长后单抗仍生成。细胞死亡阶段的qMAb约是生长阶段的一半。葡萄糖和谷氨酰胺共限制下细胞对单抗的生产能力比葡萄糖和谷氨酰胺单独限制时小。     

谷氨酰胺限制对rCHO细胞生长和代谢的影响

考察了rCHO细胞(Ch inese ham ster ovary,中国仓鼠卵巢细胞)在批培养和谷氨酰胺限制流加培养过程中的生长、代谢特性。实验发现随着谷氨酰胺浓度的下降,谷氨酰胺的比消耗速率以及氨和丙氨酸的比生成速率显著下降。与批培养相比,在谷氨酰胺限制流加培养过程中,培养时间延长,活细胞密度增加,达到2.4×106cells/mL;谷氨酰胺的代谢途径发生改变,代谢副产物生成明显减少,YAmm/G ln由1.04 mm o l/mm o l略微下降到0.92 mm o l/mm o l,YA la/G ln由0.35 mm o l/mm o l下降到0.08 mm o l/mm o l,YX/G ln由0.383×109cells/mm o l增加至0.504×109cells/mm o l,YAmm/X由2.59×1-0 9mm o l/cell下降到1.85×1-0 9mm o l/cell,表明谷氨酰胺代谢的能量利用率显著提高,也证明其参与细胞合成代谢的分率增加。     

rCHO细胞无血清适应及悬浮培养

考察了血清对rCHO(C28)细胞生长与产物(HBsAg)表达的影响,发现φ血清<0.01时细胞出现明显的代谢转换;考察了微量元素、氢化可的松、混合脂类与短多肽混合物(TL混合物)对细胞的影响,建立了适于rCHO(C28株)生长的无血清培养基MT-SFM;在将细胞从有血清转到无血清状态时,阶段性降血清比直接降血清更有利于rCHO(C28)细胞的无血清适应;当细胞适应了MT-SFM无血清培养基后,批培养中细胞的最大平均比生长速率可达0.65d-1,产物HBsAg的滴度在32～64之间。     

葡萄糖和谷氨酰胺浓度对杂交瘤细胞生长代谢的影响

在生物反应器的批培养过程中考察了葡萄糖及谷氨酰胺浓度对杂交瘤细胞生长及代谢的影响。当葡萄糖浓度降至1～4mmol／L，谷氨酰胺浓度降至0．4～2mmol／L时，细胞生长并未受到明显影响，但细胞代谢途径发生转换，乳酸及氨的生成显著减少。葡萄糖和谷氨酰胺浓度的比例对杂交瘤细胞的生长及代谢也有影响，葡萄糖相对较多时，其细胞得率小，乳酸得率大；而当谷氨酰胺相对较多时，其细胞得率小，氨得率大。实验结果表明谷氨酰胺与葡萄糖的能量代谢在某种程度上可进行相互补充。     

葡萄糖限制的流加培养中杂交瘤细胞生长、代谢和单抗生成

研究了葡萄糖限制的流加培养和批培养中杂交瘤细胞的生长、代谢和单抗生成。与批培养相比，流加培养的培养周期长，细胞密度、单抗浓度高。随着葡萄糖浓度的下降，葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率也下降，葡萄糖转化成乳酸的比例从60％～70％下降到0，葡萄糖更多地参与三羧酸循环，提高了葡萄糖的有效利用率和ATP的生成效率。     

杂交瘤细胞流加培养过程中不同拟稳态下的代谢动力学分析

采用流加培养方式,实现了杂交瘤细胞在营养物富裕、葡萄糖限制和谷氨酰胺限制3种条件下的拟稳态培养。代谢动力学分析表明:葡萄糖限制时,葡萄糖比消耗速率(qGluc)降低到1.1×10-9mmol/(cell·d),相比营养物富裕时降低了40%以上;乳酸生成量降到最低。谷氨酰胺限制时,谷氨酰胺的最小比消耗速率(qGln)约为0.28×10-9mmol/(cell·d),相比营养物富裕时降低了56%以上;氨的比生成速率降低到0.23×10-9mmol/(cell·d),营养物富裕时为0.93×10-9mmol/(cell·d);丙氨酸的生成降到最低。3种拟稳态下单抗的比生成速率都在29×10-9~37×10-9mg/(cell·d)。本文的流加培养设计方法为快速认识细胞的代谢规律,设计相应的培养基和调控策略,实现细胞高密度和产物高浓度的培养过程提供了指导。     

短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对拟茎点霉的拮抗作用

【目的】短小芽孢杆菌LYMC-3菌株对稻瘟病、黄瓜枯萎病及棉花黄萎病等具有显著的防治效果,测定LYMC-3菌株对8种植物病原真菌的抑菌活性,检测其抑菌谱,为其推广应用提供依据。【方法】采用平板对峙法测定LYMC-3菌株对松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)、松树脂溃疡病菌(Fusarium circinatum)、金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)、拟茎点霉(Phomopsis macrospora)、七叶树壳梭孢菌(Fusicoccum aesculi)、拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)、山茶炭疽菌(Guignardia camelliae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothiorella)8种植物病原真菌的抑菌活性,筛选出抑菌活性最强的病原真菌,进行菌丝生长和孢子萌发抑制试验。【结果】LYMC-3菌株对8种供试植物病原真菌均有抑制作用,抑菌带长度及抑菌活性大小依次为:拟茎点霉>拟盘多毛孢>葡萄座腔菌>松球壳孢菌>七叶树壳梭孢菌>金黄壳囊孢菌>松树脂溃疡病菌>山茶炭疽菌。LYMC-3菌株发酵滤液对拟茎点霉菌丝生长的抑制率为70.36%,对其分生孢子24 h萌发抑制率为88.16%。【结论】短小芽孢杆菌LYMC-3菌株抑菌谱广,其发酵滤液对拟茎点霉有较强的拮抗作用。