棒状杆菌亮氨酸操縱子在大肠杆菌中的克隆和表达

以质粒pTZ22为载体,用HindШ限制酶切割谷氨酸棒状杆菌染色体DNA进行克隆。分离到带有亮氨酸操纵子的4.5kb片段。用Southern切口移位分子杂交检测,证明在4.5kb的片段中既包含有leuB基因,而且对leuA基因也表现同源性。     

大肠杆菌BL21(DE3)氨基葡萄糖代谢调控相关基因的敲除及glmS在其中的表达研究

氨基葡萄糖(Glucosamine,GleN)是一类广泛使用的保健品,对于人类软骨再生及关节炎的临床治疗都具有良好的疗效.为构建以代谢工程为基础的氨基葡萄糖生产菌株,采用λRed同源重组系统将大肠杆菌BL21(DE3)中甘露糖-磷酸转移酶系统操纵子(manXYZ)和乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转运和代谢特异性系统操纵子(nagBACD-nagE)进行双剔除.随后构建含新型氨基葡萄糖合成酶基因(glmS)的表达载体pETG,并将它转化该双操纵子剔除菌株.结果表明,改造后的菌株不能以GleN或GlcNAc作为碳源进行代谢生长.表达GlmS菌株的上清液经Ni-NTA亲和层析纯化,其酶活性达8.63 U/mg,表明该菌株已具备发酵生产GleN的初步特性.     

降钙素基因相关肽衍生物的制备及降血压功能研究

用PCR法将人的降钙素基因相关肽(calcitonin gene related—peptide,CGRP)基因克隆到表达载体pGEX-4T-2的GST基因后,构建成一个新的表达质粒pGEX—CGRP．另外分别将2个有降压功能的小肽HHL和RPLKPW的基因克隆到CGRP基因后,构建成2个表达质粒pGEX—CGRP-3AA和pGEX—CGRP-6AA．将此3个表达质粒转化到大肠杆菌TG1中,获得3个高表达的融合蛋白：GST—CGRP,GST—CGRP—HHL,GST—CGRP—RPLKPW;通过G1utathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白,测定蛋白浓度,利用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)来检测蛋白的降血压功能,发现融合蛋白GST—CGRP—HHL具有显著的降压效果,能使舒张压下降8．0kPa,且降压维持时间延长,达到70min以上．     

2个棒状杆菌质粒pXZ10142和pXZ10145.1及其转座子TN45的特征分析

对1株棒状杆菌1014中分离到的2个质粒pXZ10145．1和pXZ10142进行了相互关系分析．序列分析显示pXZ10142源自pXZ10145．1．pXZ10145．1包括6个开放读码框(open reading frame,ORF),其中ORF1编码247个氨基酸,经缺失分析是复制酶．在pXZ10145．1上发现1个转座子TN45,转座子上有CMR基因和TNP基因．一对颠倒重复序列IR1a和IR1b位于pXZ10145．1和pXZ10142的交互处,两边是顺向重复序列ATCTAG．     

以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗O型口蹄疫病毒重组活菌苗在家兔体内免疫应答的初步研究

将含有口蹄疫病毒疫苗基因的真核表达质粒pBO1经过中间宿主鼠伤寒沙门菌LB5010修饰后,电转化到减毒的猪霍乱沙门菌C500中,构建成抗O型口蹄疫病毒的重组活菌苗pBO1／S．cho．血清凝集实验验证,筛选到的转化菌仍然具有猪霍乱沙门菌的血清学特性,即具有免疫原性．采用口服方式免疫家兔,检测重组菌在家兔体内诱导的免疫应答．家兔免疫后8周,分离脾脏T细胞,检测T细胞增殖情况．结果显示,口服DBO1／S．fho的家兔T细胞在FMDV特异性抗原的刺激下有明显的增殖反应,刺激指数SI〉11;免疫后2周和8周分别取家兔静脉血,用液相阻断ELISA法检测血清中针对FMDV的特异性抗体,pBO1／S．cho组家兔产生的抗体效价为1／32。     

插入Tn21质粒的分离和链霉素抗性基因质粒的组建

在携带R100.1和pSO101质粒的Lc2640细胞中分离到重组质粒pXZ2712,该质粒对链霉素、氯化汞、磺胺和四环索有抗性。用仅带有Tn21两个末端的质粒pXZ2作为探针进行分子杂交,发现两者有同源性,说明质粒pXZ2712是由Tn21插入质粒pSC101所组成的。以pXZ2712质粒中分离到的带有链霉素抗性基因的片段,组建了带有抗链霉素基因的pXZ6(14.5kb)、pYP1(9.7kb)、pYP22(9.1kb)和pYP4(4.0kb)等质粒载体。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建Asia Ⅰ型口蹄疫病毒多肽疫苗,用反转录PCR方法扩增VPI基因并测得该基因的核苷酸序列．将VPI（133AA-163AA）、VP2（1AA～33AA）抗原表位基因分别与卢一半乳糖苷酶基因（简称LacZ＇）3’末端相连构建表达质粒LacZ’-VIP和LacZ’-VP2．化学合成VP1（133AA～163AA）-VP2（1AA～33AA）-VPl（133AA～163AA）串联重复抗原表位DNA,然后分别连接在β-半乳糖苷酶基因和IgG重链恒定区基因的3’末端,构建两种重组表达质粒LacZ’-VPl（133AA--163AA）-VP）2（1AA～33AA）-VP1（133AA-163AA）（命名为pTl）和IgGvPl（133AA～163AA）-VP2（1AA～33AA）-VPl（133AA-163AA）（命名为pT2）．通过Westernblot、血清中和抗体效价测定、T细胞增殖反应及豚鼠抗病毒保护实验分析所构建疫苗的免疫原性及有效性．结果显示pT1、pT2表达的融合蛋白能够诱发豚鼠产生较高的中和抗体及刺激豚鼠T细胞增殖．pT1、pT2两种融合蛋白分别2次免疫豚鼠后,100％的豚鼠能抵抗100 ID50 AsiaⅠ型口蹄疫病毒攻击．pT2融合蛋白1次免疫豚鼠后70％的豚鼠能抵抗100 ID50 AsiaⅠ型口蹄疫病毒攻击．     

多个发夹RNA的混合使用抑制O型和AsiaⅠ型口蹄疫病毒的复制

通过对国内流行的口蹄疫病毒(FMDV)毒株的序列分析,锁定RNA干扰的3个目标基因即3D,VP4和2B, 分别编码聚合酶POL,病毒结构蛋白VP4和非结构蛋白2B,这3个靶基因序列在不同流行毒株之间相对保守.分别设计合成靶向这些基因序列的发夹RNA(short-hairpin RNA,shRNA)表达模板,构建了5个shRNA表达质粒p3D-NT56,p3D-NT19,pVP4-NT65,pVP4-NT19和p2B-NT25.进行单独应用或混合应用,于细胞水平和乳鼠水平检测其抗病毒活性.结果显示,3D-NT56/19,VP4-NT65/19和2B-NT25 shRNA对O型FMDV均有抑制作用,但是对AsiaⅠ型FMDV,仅2B-NT25 shRNA具有较显著的抑制作用.3个shRNA表达质粒的混合使用(p3D-NT56+pVP4-NT65+p2B-NT25,p3D-NT19+pVP4-NT19+p2B-NT25),不仅能够交叉抑制不同血清型FMDV的复制,而且这种抑制作用较单一shRNA延续更长的时间.     

天蓝色链霉菌产十一烷基灵菌红素的发酵条件优化

通过对天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor ZB8）产十一烷基灵菌红素（Red）的摇瓶发酵条件进行的优化研究,初步确定了促使Red产率提高的培养基组成及培养条件,包括研究接种量、碳源、氮源、氨基酸、无机盐及初始pH等对Red合成的影响,并通过正交试验获得了最适培养基组组成.用该培养基培养Stre...     

棒状杆菌表达载体pJL23的构建

质粒ｐＧＡ４６－４带有从谷氨酸棒杆菌染色体上分离到的有启动功能的片段,用ＰＣＲ技术从ｐＧＡ４６－４中扩增了该片段的关键区域;启动子ＰＧＬ,将该启动子经ＥｃｏＲⅠ－ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后,与大肠杆菌质粒ｐＪＬ０１的ＥｃｏＲⅠ－ＢａｍＨⅠ大片段连接,再接入Ｘｙｌ Ｅ ｇｅｎｅ和棒状杆菌质粒ｐＸＺ１０１４２,构建成棒状杆菌－大肠杆菌穿梭表达载体ｐＪＬ２３。用邻苯二酚双加氧酶基因检测表明,该表达载体可在棒状