固相金属亲和层析纯化全长人PPARγ重组蛋白

建立全长人PPARγ重组蛋白的固相金属亲和层析纯化方法.利用E.coli BL21 (DE3)细胞外源性表达出全长人PPARγ重组蛋白,采用固相金属亲和层析法纯化目标蛋白.通过考察咪唑浓度对纯化的影响,确定在8 mol/L尿素下,用含50 mmol/L咪唑的缓冲液冲洗,200mmol/L咪唑缓冲液洗脱,可获得纯度为95％的目标蛋白,透析复性后经放射配体受体饱和结合实验测定全长人PPARγ重组蛋白的解离常数Kd为106士6nmol/L.结果表明本文所建立的方法能够成功纯化出高纯度的目标蛋白,经复性后,可获得用于结构和功能研究的全长人PPARγ重组蛋白.     

1-氨甲基-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐的合成及表征

以3,4-二甲氧基苯乙胺为原料,经氯乙酰氯酰化得到N-氯乙酰基-3,4-二甲氧基苯乙胺,通过与邻苯二甲酰亚胺钾烃化,在P2O5的作用下经Bischler-Napieralski环合后,用水合肼肼解,硼氢化钾还原后与盐酸作用得1-氨甲基-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉盐酸盐。产品结构经IR、1H NMR、MS确证。     

全长hPPARγ重组蛋白的可溶性表达、纯化及活性鉴定

建立细菌外源性表达的有活性的全长hPPARγ重组蛋白的纯化方法.利用pReceiver-B13-SUMO-PPARγ表达质粒转化至E.coli BL21 (DE3)细胞中诱导表达获得的全长hPPARγ重组蛋白;采用阴离子交换色谱法纯化目标蛋白;采用分子排阻色谱-高效液相色谱法(SEC-HPLC)法测定全长hPPARγ重组蛋白与Ros (Rosiglitazone,罗格列酮)配体的结合活性.经DEAE-52阴离子交换树脂一次纯化,从每升LB培养介质中可获得135mg、纯度为80％目标蛋白;该蛋白与罗格列酮的解离常数Kd为492nmol/L.本文所建立的方法能纯化出大量有活性、纯度较高的全长hPPARγ重组蛋白.