人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸的生物活力测定

本文报道了用一种高灵敏度的方法测定人工合成的酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的生物活力。tRNA_y~(Ala)在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下接受丙氨酸后,用操作简便而回收率较高的酒精沉淀法回收氨酰化产物,最后,在兔网织红细胞裂解液无细胞蛋白合成体系中,测定氨酰化产物中的丙氨酸转移到蛋白质中去的能力——参入活力。这方法不仅可以测定分离纯化的tRNA_y~(Ala)的活力,而且也可以测定经T_4RNA连接酶连接两个半分子后的反应混合物中产物tRNA_y~(Ala)的活力。利用这方法,已成功地测定了微至5—7 pmoles的人工全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力和参入活力两组数据。测定结果表明,全合成tRNA_y~(Ala)的接受活力是天然分子的51.6—65.6％,是经拆合的天然分子的91.3—106.0％。其氨酰化产物中的[~3H]-Ala在兔网织红细胞裂解液中的利用率为61.6—63.1％,是天然分子的90.6—91.7％,是经拆合的天然分子的97.2—115.8％。     

啤酒酵母PRO3基因的克隆、表达及鉴定

酵母菌的脯氨酸合成代谢途径及其酶基因的研究是近几年才开始的。我们曾在细菌中克隆了酵母的PRO2基因。在此基础上,我们又进一步克隆了PRO3基因。它不仅能在酵母中很好互补,也能在细菌中高效表达,并且都能测到很高的酶活力,说明了此基因在真核酵母菌和原核细菌中都能利用它们的转录,翻译等系统。当PRO3基因克隆到多拷贝质粒上后,不论在酵母中,还是在细菌中,其基因产物的活性并不比在单拷贝染色体上的活性高。说明此基因的表达在调节上有着它的特殊性。     

利用Ty片段构建高稳定的整合型酵母菌表达载体

本文提出了一种利用酵母转座子Ty因子的新战略.本文中构建的酵母整合型质粒含有TyH25片段,利用这一片段与染色体之间的同源重组,可把质粒上的目的基因带入染色体,并可获得相当稳定的表达.本文还报道了GAL4基因和CUP1基因的稳定表达.脉冲梯度电场电泳(PFGE)揭示,质粒上的同一基因可以整合到不同的染色体上.Southern杂交分析表明,质粒整合的靶位点具有较高的结构相似性;整合后的质粒可以以单拷贝形式,也可以成串排列的多拷贝形式存在.我们还发现,随着整合情况的不同,质粒中同一目的基因在不同转化子中表达的情况也不尽相同.     

ASSAY OF BIOLOGICAL ACTIVITY OF SYNTHETIC YEAST ALANINE TRANSFER RNA (tRNA_y~(Ala))

The biological activity of the synthetic tRNA_y~(Ala) was studied with an extremely sensitive method, tRNA_y~(Ala). accepted alanine in the presence of rat liver aminoacyl-tRNA_y~(Ala)-synthetase (this was called the accepting actvity). The aminoacylated tRNA_y~(Ala) was conveniently precipitated by ethanol with good recovery. The efficiency of transferring alanine from the aminoacylated tRNA_y~(Ala) into the protein was determined in in vitro rabbit reticulocyte lysate cell-free protein-synthesizing system (this was called the incorporation activity). Both accepting and incorporation activities could be determined in one assay with only 5-7 pmoles of tRNA_y~(Ala) either in ligation mixture or in purified form.Our results show that the accepting activities of the synthetic products were 51.6-65.6% and 91.3-106.0% of that of natural and reconstituted natural tRNA_y~(Ala) respectively. The efficiency of the incorporation of alanine in the aminoacylated tRNA_y~(Ala) into the protein was 61.6-63.1%, corresp     

λDNA限制片段上的基因在大肠杆菌中的表达

我们用EcoRI及BamHI两种限制性核酸内切酶来酶解质粒pBR322成为pBR322C(375bp)及pBR322B(3987bp),并同样酶解λc1857S₇ DNA的EcoRI限制片段λF₂(λDNA的65.5—81％片段)成为λF₂A(DNA的65.6—71.3％片段,2679bp)及λF₂B(λDNA的71.3—81％片段,4559bp).再用T₄-DNA连接酶将pBR322B及λF₂B重组成为一个新质粒,叫做pCB₂,其上具有cI基因,cro基因及启动基因.这是从随机挑取的338个菌落中筛选出来的第48号菌.pCB₂赋予转化子以单抗药性(Ap^r)及对λcI₈₅₇S₇感染的免疫性.用电子显微镜及凝胶电泳测定,pCB₂ DNA分子长度为2.66±0.33微米,分子量为5.51±0.68×10⁶d.用λF₂与Eco RI切割成线状的pCB₂在一起形成的异源双链图形和以上数据.都说明这一新质粒与建造时的设计相符.其中的_cI基因及/或cro基因在大肠杆菌中得到表达.     

α-FACTOR-DIRECTED SYNTHESIS AND SECRETION OF β-SUBUNIT OF HUMAN CHORIOGONADOTROPIN (β-hCG)IN YEAST S. cerevisiae

A couple of sbuttle vectors (pYNA and pYNB), containing a sequence coding for the leader regionof the α-factor precursor (α-factor leader sequence) and the origin of 2μm circle, were constructed. ThecDNA for the β-hCG (145aa) was fused in phase to the 3'-end of the α-factor leader sequence andtransformed into the yeast Saccharomyces cercvisiae. The yeast cells carrying this hybrid gene synthesizedand secreted a protein with the immunoactivity of β-hCG in an amount of 45μg per liter of culture. Thepreliminary characterization of this protein is also reported in this paper.     

α-因子指导下β-hCG在酵母中的合成和分泌

本文利用酵母接合因子α基因(MFα-1)的启动子、前导肽顺序(α-factor leader sequence)以及2μm质粒复制起始顺序(2μori)构建了一组酵母-大肠杆菌穿梭分泌型表达载体(pYNA,pYNB)。将人绒毛膜促性腺激素β-亚单位(β-hCG)基因(145肽顺序)融合于这一前导肽顺序的3′端,在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中得到表达和产物分泌。表达产物与天然β-hCG全抗体及单克隆抗体都有免疫反应。用β-hCG放射免疫双抗试剂盒测到每升培养物含有45μg产物。对这一产物的部分特性做了初步鉴定。     

人表皮生长因子受体cDNA在酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达

人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,简称hEGFR)是一个170kD的穿膜糖蛋白。利用酵母诱导型Gall启动子,hEGFR cDNA被成功地在酵母细胞中表达,其转录产物(mRNA)大小约为3.5kb。免疫荧光显微实验显示该mRNA的翻译产物(hEGFRy)是位于酵母细胞质膜上,并且hEGFRy具有与EGF结合的功能。本文还进一步证明了酵母2μm质粒的2kb的片段的确具有转录终止的功能。