盐生盐杆菌生长过程热动力学研究

用 LKB2 2 77生物活性检测系统测定了盐生盐杆菌 R1、J7、S9以及 R1和 J7的融合子 F9生长的产热功率曲线 .根据曲线的特征 ,建立了古生菌生长过程的热动力学方程 :ln[P· ( 1 -P/Pm) r- 1 ]=ln[P0 · ( 1 -P0 /Pm) r- 1 ]+k· t.由此求得了盐生盐杆菌的生长速率常数 ,并对此模型和融合子 F9的生长进行了讨论 .该热动力学方程描述了一系列非理想的细菌生长过程的产热功率曲线 ,并将其与经典的指数式生长模型和 lo-gistic模型进行了比较 ,它具有更广泛的适用性 .首次报道了微量热技术在古生菌中的应用     

营养缺陷型酿酒酵母AY生长代谢的热动力学研究

用微量热法研究了尿嘧啶缺陷型酿酒酵母AY,和该菌株分别经穿梭质粒pYLZ2、重组质粒pYLZ2/f27、pYLZ2/622转化的3种菌株的生长代谢热动力学.尿嘧啶缺陷型酿酒酵母AY在基本培养基中不生长,没有代谢热效应产生,而在葡萄糖蛋白胨培养基和丰富营养培养基(YPD)中生长,并且在YPD中生长最好;向基本培养基中加入尿嘧啶后,AY能够生长,而且随着尿嘧啶浓度的增加,其生长速率常数增大;经质粒转化的3个菌株均能在基本培养基中生长,代谢产热曲线各不相同,与转入质粒的结构、功能密切相关.研究结果表明了各菌株遗传特征的差异.     

具有真细菌基因启动子活性的古生菌DNA片段

以大肠杆菌启动子探测质粒pKK232-8 为载体,用4 组限制性内切酶分别消化古生菌盐生盐杆菌R1(Halobacterium halobium )的染色体DNA,在体外进行重组,转化E.coliDH-5α感受态细胞,得到12 个转化子(T1～T12),其抗性水平分布在10～500 m g/L的区间内. 将这些转化子所含质粒分别命名为pSX1～pSX12,限制性酶切分析表明,这些质粒各插入了一段不同的外源DNA 片段,杂交分析表明,抗性最强的转化子T11 所含质粒pSX11 上插入了一段来源于盐生盐杆菌R1 染色体的DNA 片段. 该DNA 片段在大肠杆菌中具有启动子功能.     

嗜麦芽假单胞菌质粒pSH1的限制图谱及km~r标记的克隆

对嗜麦芽假单胞菌Ｐ２菌株（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍａｌｔｏｏｈｉｌｉａＰ２）的质粒ｐＳＨ１进行了限制酶切分析，确定了ＢｇｌⅡ、ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ、ＸｂａⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＢｇｌⅠ、及ＰｖｕⅡ共７种限制性内切酶在ｐＳＨ１、质粒上的切割位点，前４种酶均为单一切点；后３种依次为２、７、５个切点．通过双酶切和部分酶切的方法绘制了ｐＳＨ１质粒的限制酶切图谱．将ｐＧＰ１－２质粒上的卡那霉素抗性基因（ｋｍｒ）片段插入ｐＳＨ１，获得了重组质粒ｐＳＨ２．ｐＳＨ２是由ｐＧＰ１－２质粒上大小为２．９０ｋｂ的ＤＮＡ片段（含ｋｍｒ）和ｇｈＨ１经ＢａｍＨⅠ－ＰｓｔⅠ双酶切产生５．７０ｋｂ大片段组成，它能够重新转化到喀麦芽假单胞菌受体（ｋｍｒ）中，其ｋｍｒ标记能够得到稳定的表达．     

微量热技术检测古生菌启动子DNA片段的启动功能

用微量热法研究了大肠杆菌HB101及其重组菌株的代谢特征．将不同大小的来源于嗜盐古生菌染色体DNA的启动子片段插入启动子探针载体中的氯霉素抗性基因前，获得重组菌株．结果表明重组菌株的半抑制浓度与DNA片段的启动功能大小是一致的，并且质粒的复制几乎不影响菌株的生长及代谢．培养基中加入氯霉素后，启动子启动氯霉素抗性基因表达，生长速率(k)降低，最大峰的出现时间(tp)延长，最大峰值(pm)也随之降低．在一定范围内，抗生素浓度与tp、pm呈线性关系．本研究结果直接证明了来自嗜盐古生菌的RM07、RM08和RM13片段在大肠杆菌中是有启动功能的，而且还表明基因表达量的高低与释放的代谢热变化相一致．因此微量热技术有可能为检测古生菌基因表达及其调控以及揭示古生菌这一特殊生命体的遗传和代谢特征提供一种新的灵敏的方法．     

营养缺陷型酿酒酵母AY生长代谢的热动力学研究

用微量热法研究了尿嘧啶缺陷型酿酒酵母AY,和该菌株分别经穿梭质粒pYLZ-2、重组质粒pYLZ-2/f27、pYLZ-2/622转化的3种菌株的生长代谢热动力学.尿嘧啶缺陷型酿酒酵母AY在基本培养基中不生长,没有代谢热效应产生,而在葡萄糖蛋白胨培养基和丰富营养培养基(YPD)中生长,并且在YPD中生长最好;向基本培养基中加入尿嘧啶后,AY能够生长,而且随着尿嘧啶浓度的增加,其生长速率常数增大;经质粒转化的3个菌株均能在基本培养基中生长,代谢产热曲线各不相同,与转入质粒的结构、功能密切相关.研究结果表明了各菌株遗传特征的差异.     

嗜麦芽菌素P28尾鞘基因启动子活性分析

嗜麦芽菌素P28是由嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)合成的细菌素,启动子Ps控制其主要结构基因(尾鞘基因和尾管基因)的转录.本研究首先用RACE方法确定嗜麦芽菌素P28的主要结构基因转录起始位点位于尾鞘基因翻译起始位点ATG上游47bp处的G碱基,然后以lacZ(β-半乳糖苷酶基因)为报告基因对201bp长的启动子Ps从5′端进行缺失突变,发现具有启动活性的最小启动子片段长度为55bp.当启动子片段截短为89bp时,启动子Ps-89活性不仅有明显升高,同时不受丝裂霉素C影响.扫描突变分析Ps-201启动子中124bp与89bp之间的碱基,结果显示,碱基序列-GTCTG-是Ps-201的关键调控序列,突变后活性提高了2.53倍.     

5株细菌产L-多巴黑色素的比较研究

对5株细菌所产黑色素的物理和化学性质及发酵进行了比较研究。结果表明：尽管这些不同来源的黑色素在理化性质上存在一定差异，但它们的基本框架结构及主要基团是一致的，且在发酵过程中都检测到L-多巴，说明它们都属于多巴类黑色素；不同菌株在同一条件下和同一菌株在不同条件下发酵黑色素的产量差别很大。其中WS和H2的黑色素产量可分别达到1720mg／L和1040mg／L，有进一步开发成为工业发酵生产黑色素应用菌株的潜力。     

嗜盐古菌染色体DNA片段在大肠杆菌中的启动子功能

以启动子探针质粒pKK232-8为载体, 用微量量热法研究了源自盐生盐杆菌R1染色体的RM13 DNA片段在大肠杆菌HB101中的真细菌启动子功能, 该启动子RM13 DNA片段的大小为1000bp(碱基对), 它能启动探针质粒pKK232-8上的氯霉素乙酰水解酶基因(即:氯霉素抗性基因Cmr), 氯霉素抗性水平可达到150 mg•L－1, 抗性水平较高, 启动活性较大.研究结果表明, 在盐生盐杆菌染色体上可能存在具有双功能或多功能的启动子DNA片段, 这对系统发育、微生物遗传学和生物热化学等均有重要的意义.     

极端嗜盐古生菌启动子序列缺失突变的微量热研究

用微量热方法和DNA缺失突变技术研究了来源于极端嗜盐古生菌R1上的一个推测的启动子片段(RM10)在大肠杆菌中的启动子功能. 启动子片段融合到质粒pKK232-8上无启动子的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因前来检测它驱动基因表达的能力, 缺失分析RM10启动子片段定位具有启动活性的重要功能区. 实验结果从热动力学角度揭示, 这个启动子片段上含有－35区和－10区特征的1382～1517 bp(碱基对)区段是它在大肠杆菌中具有启动子功能的关键部分; 在1～1382 bp区段或1571～1848 bp区段上还存在它的负调控区. 该研究为基因启动子功能研究提供了一种新的、更加灵敏便捷的、化学与生物学相结合的方法.