二核苷-磷酸在RNA连接酶酶促反应中的受体作用

本文在前文的基础上,对含有稀有核苷的十四种二核苷-磷酸同32_pN_p的单加反应作了进一步的研究。经对各类同系层析图谱和各类酶解分析,结果说明反应温度,供体的差异性,受体的碱基差异性等等对此反应影响很大。     

化学合成的亮氨酸脑啡肽基因在大肠杆菌中的克隆和表达

化学合成的亮氨酸脑啡肽(LEK)基因与质粒pBR322重组,转化大肠杆菌,经过原位杂交筛选,限制性图谱分析和Southern杂交鉴定,获得一批LEK基因重组体。插入乳糖操纵子(1ac)启动基因控制LEK基因的表达。一个lac转录方向和LEK基因转录方向相同的表达质粒,pLE103,能在大肠杆菌中产生LEK。用放射免疫分析方法检测,LEK的产量可达每毫克细菌蛋白426毫微克。     

聚合酶链反应用于高效的基因改造

本文报道利用近年来发展起来的基因体外扩增技术——聚合酶链反应(PCR)进行高效的基因定向改造的结果。在构建新的EcoRI基因表达质粒时,为了在EcoRⅠ基因SD序列前改变一个碱基引入SalⅠ切点以缺失其启动子,同时将Glul44改造成Lys,我们回收分离pER101的1.5kb SalⅠ/PatⅠ片段作为模板,合成各带一个错配的两个25聚DNA片段作为扩增引物,利用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增,结果经过30个循环,从约0.05μg模板DNA得到约10μg的0.49kbDNA。根据理论计算,扩增产物中突变片段占99％以上。用SalⅠ/BglⅠ酶切克隆入pUCl9 SalⅡ/BamHI,任意取两个重组子进行序列分析结果表明都发生了预期的突变。扩增产物已被克隆入pER304,使得EcoRl(Lys-144)基因置于PL下游以实现其控制的高表达。     

DINUCLEOSIDE MONOPHOSPHATE ACTING AS THE SHORTEST ACCEPTOR IN T_4 RNA LIGASE REACTION

A thorough study on the reaction of 32_pN_p with 14 dinucleoside monophosphates including U_pI and C_p m~1I has been reported. The 10μl reaction mixture containing 100mM Tris (pH8.3), 40mMMgCl_2, 6.6mM DIT, bovine serum albumin (20μg/ml), 1mM ATP, 0.25mM dinucleoside monophos-phate, 0.05mM 32_pN_p and T_4 RNA ligase was incubated for 24 hr at 5--10℃ (or 2 hr at 37℃).The joining yields depend on the reaction temperature, the donor species and the base compositionof acceptors,_pC_p is the best donor. At 5--10℃, it can join in all 14 dinucleoside monophosphateswith yields ranging from 20% to 80%. The next one is _pA_p, but the yields are comparatively low.Both _pG_p and p_U_p are poor donors, which react with some dinucleoside monophosphates to give ayield of only a few percent, and sometimes no product could be obtained whatsoever.     

EcoRI N端肽段的定点缺失研究

本文报道了一种定点缺失任意大小的DNA片段的基因裁剪方法,它建立于聚合酶链反应(PCR)的扩增、Klenow平端修饰和克隆等过程.所建立的方法被用来研究了EcoRI,方便地构建了两个从N端开始的缺失突变株EcoRI(Δ45aa)和EcoRI(Δ89aa),这说明所建立的定点缺失方法是有效的;突变株的SDS-PAGE和底物结合试验等结果表明:螺旋(29—43)对于EcoRI结合底物GAATTC十分重要.     

亮-脑啡肽基因的合成

本文报道亮-脑啡肤基因的另一个合成途径。合成的基因,26个碱基对,是按照亮-脑啡肽的氨基酸顺序设计的。为了能够插入pBR 322质粒,基因带有EcoRI和BamHI限制性内切酶的单链粘性末端。化学合成的4个片段,8、9、17及18核苷酸,采用改良的三酯法。这些片段都具有正确的结构,最后在T_4-DNA连接酶的作用下,一步装配成脑啡肽基因。产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化,具有正确的连接点。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸5′-半分子(1—35)的合成

本文报道了应用T_4RNA连接酶将酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))5′-半分子中的三个寡核苷酸片段[—13(Ⅰ);14—22(Ⅱ);23—35(Ⅲ)]连接成5′-半分子的工作。由于寡核苦酸片段的纯度高,多核苷酸激酶和T_4RNA连接酶的质量好,采用连续反应的方法,简化了分离步骤,使产物的得率大大提高,二十二核苷酸的连接率是75％,三十五核苦酸的连接率是90％,以第一步反应原料为基数计算,最终产物的总得率是21％。经连接点和末端核苷酸分析,证明它的结构是正确的。将合成的5′-半分子与天然的3′-半分子在T_4RNA连接酶的催化下连接成人工半合成的完整tRNA_y~(Ala),具有接受[~3H]-丙氨酸和将[~3H]-丙氨酸转移到蛋白质中的生物活力。     

肽键的酶促合成

所谓肽键的酶促合成,实际上是指利用蛋白水解酶的逆转反应或转肽反应来进行的肽键合成。近年来,本方法有了某些新发展。它作为多肽化学合成的一个辅助和补充的方法,已经成功地用于许多小肽以及像脑啡肽和增血压素等生物活性肽的合成,更成功地是用于某些蛋白质如胰岛素、胰蛋白酶抑制剂,牛胰核糖核酸酶A、葡萄球菌核酸酶和细胞色素C等的结构与功能关系的研究。本文就最近研究概况作一简单介绍。     

酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工全合成

本文报道采用有机合成与酶促合成相结合的方法,按照R.Holley等测定又经他人修正的一级结构,人工全合成了酵母丙氨酸转移核糖核酸(tRNA_y~(Ala))的工作。我们合成的tRNA_y~(Ala)与天然的tRNA_y~(Ala)具有相同的化学组成(含有全部修饰核苷酸)和结构,并有完整的生物活力,即在大鼠肝氨酰基tRNA合成酶的催化下,能接受丙氨酸,而且在兔网织红细胞裂解液体系中能将所携带的丙氨酸参入到蛋白质中去。在进行全合成以前,曾分别进行了两种人工半合成,即将天然的5′半分子与人工的3′半分子和人工的5′半分子与天然的3′半分子进行连接,都取得有生物活力的整分子tRNA_y~(Ala)。据我们了解,这是世界上第一次用人工方法合成的具有生物功能的核糖核酸。     

CHEMICAL SYNTHESIS AND CLONING OF SECRETIN GENE

A DNA duplex coding for the 27 amino acids of secretin has been synthesized and cloned. Indesigning the sequence of the gene, computer analysis has been applied. The following factors have beenconsidered: selection of codon usage in favour of expression in yeast; design of various sites useful ingene cloning, gene modification and expressed product purification; avoiding the repeat sequences whichmay interfere in the ligation of the synthetic fragments. The synthesis involved preparation of 12 oligo-deoxyribonucleotides (12-mer to 24-mer in length) by phosphate triester and phosphite triester method,purification by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). A new plasmid pWS1 was constructed by inser-tion of the enzymatic ligated gene fragment into plasmid pWR13.